Analisi strutturale e funzionale di complessi tra Immunoglobuline G e "Heat Shock Proteins" isolati da plasma umano e ricostituiti "in vitro". Implicazioni fisio-patologiche nell'insorgenza di alterazioni vascolari in patologie infiammatorie ed autoimmuni.

In questa tesi sono descritti gli esperimenti finalizzati a dare una risposta ad alcuni importanti quesiti sollevati da una precedente ricerca che aveva identificato nel plasma di soggetti diabetici di tipo 1 (insulino-dipendenti) una Heat Shock Protein (HSP) Grp94 (Glucose-regulated protein94) che circolava in complessi stabili con le IgG e presentava caratteristiche proprietà strutturali e funzionali. Gli obiettivi del progetto di ricerca riguardavano: la verifica del ruolo di immunogeno della Grp94 e la conferma della sua natura di antigene circolante comune nel diabete; la caratterizzazione strutturale e funzionale dei complessi della Grp94 plasmatica, per capire se i complessi possono rivestire il ruolo di marker biologico di danno vasale precoce; la formazione di complessi di Grp94 con IgG in vitro, da utilizzare come sostituti dei complessi trovati nel plasma a scopo investigativo, negli studi sugli effetti biologici e loro meccanismi molecolari. La ricerca ha previsto l’impiego di una serie di tecniche diverse, comprendenti quelle relative alla purificazione e caratterizzazione delle proteine da materiale biologico, analisi della struttura e misurazione di attività biologica su colture cellulari (cellule di derivazione umana) e in sistemi isolati in vitro. I risultati hanno permesso di dare una risposta esauriente ai quesiti iniziali, confermando l’ipotesi che i complessi circolanti di Grp94 con le IgG sono un indice dell’aumentato rischio di danno vasale. Soprattutto, è stato possibile avere informazioni importanti al riguardo dall’impiego dei complessi ottenuti in vitro incubando la Grp94 nativa con le IgG umane non-immuni. I complessi formati in vitro hanno evidenziato delle caratteristiche comuni con quelli circolanti nel plasma, specialmente per quanto riguarda gli effetti biologici di stimolazione della crescita cellulare ed induzione della differenziazione angiogenetica di cellule endoteliali di cordone ombelicale umano. Sono emersi comunque anche aspetti strutturali e funzionali differenti, legati alla differente natura delle IgG coinvolte nel legame alla Grp94: mentre infatti nel plasma la natura immune delle IgG stabilisce che il legame avvenga al sito di riconoscimento antigenico sui Fab, nel complesso in vitro, con le IgG non-immuni, sono coinvolti siti diversi, molto probabilmente localizzati in corrispondenza della regione hinge della molecola di IgG. Nonostante che gli effetti biologici esplicati dai complessi di Grp94, sia immuni che non-immuni, potessero essere imputabili alla Grp94 che, allorché testata da sola produceva effetti qualitativamente simili a quelli dei complessi, i risultati hanno dimostrato che la Grp94 in complesso si differenzia per una maggior capacità di stimolare il processo di differenziazione cellulare rispetto alla Grp94 sola che invece ha rivelato una più intensa attività di stimolo sulla proliferazione. L’indagine approfondita sull’entità e la sequenza temporale di attivazione dei processi di proliferazione e differenziazione cellulare, nonché delle vie di segnale cellulare coinvolte dalla Grp94, da sola e in complessi, ha permesso di concludere che proprio i complessi di Grp94, che sono la forma in cui la Grp94 si riscontra più frequentemente nel plasma, nelle condizioni patologiche associate alla liberazione extra-cellulare di questa HSP, possono essere responsabili del processo di trasformazione delle cellule dell’immunità, sia nativa che adattiva, che rende ragione della capacità della Grp94di stimolare la risposta immunitaria.