The role of mitochondria in shaping the oncogenic signaling

Le cellule tumorali hanno la capacità di riprogrammare il metabolismo al fine di sostenere la crescita cellulare e di sfuggire ai segnali di morte. Un ruolo centrale in questo processo è a carico delle vie di segnale, principalmente regolate da chinasi. L’integrazione degli stimoli di morte e di sopravvivenza avviene nei mitocondri, dove molti di questi segnali convergono sulla regolazione di un canale, il poro di transizione di permeabilità (PTP), che è responsabile della depolarizzazione mitocondriale con il conseguente rilascio di fattori pro-apoptotici dall’organello. L’apertura del PTP porta le cellule alla morte ed è regolato da un’ampia varietà di fattori. In questo lavoro ho studiato come i meccanismi di trasduzione del segnale impattano sul metabolismo cellulare, in particolare sulla bioenergetica mitocondriale, giungendo quindi ad una modulazione dell’apertura del PTP. Nella prima parte del mio lavoro ho indagato la presenza del PTP in cellule depletate del DNA mitocondriale (cellule ρ0) che presentano una totale assenza della respirazione e costituiscono un buon modello per l’analisi del coinvolgimento dei mitocondri in molte condizioni patologiche tra cui il cancro. Ho osservato che queste cellule possiedono un PTP funzionale, i cui meccanismi di regolazione sono simili a quelli presenti nelle cellule tumorali. Nel dettaglio, l’inibizione dell’apertura del PTP è un meccanismo di sopravvivenza raggiunto attraverso due meccanismi: il primo riguarda la localizzazione mitocondriale dell’enzima glicolitico esochinasi (HK) II, che è over-espresso nelle cellule ρ0; il secondo meccanismo è basato sull’iper-attivazione della via di segnale ERK-GSK3 che converge sui mitocondri dove mantiene il regolatore del poro, la ciclofilina D (CyP-D), nello stato defosforilato e quindi inattivo. Ho osservato che i mitocondri delle cellule ρ0 mantengono un potenziale di membrane che è dissipato in seguito alla dislocazione del HK II dalla superficie mitocondriale attraverso trattamento con clotrimazolo o tramite l’uso di un peptide che permea le membrane, o, in alternativa, a seguito di deplezione di siero e glucosio. L’inibitore del poro, la ciclosporina A (CsA), è in grado di diminuire la depolarizzazione mitocondriale indotta dalla dislocazione del HK II o dalla deplezione di nutrienti. Inoltre, la deplezione di siero e glucosio causa una concomitante inibizione di ERK1/2, un’attivazione di GSK3α/β e una conseguente fosforilazione di CyP-D con apertura del PTP. Infatti, inibendo GSK3α/β con l’indirubina, la morte cellulare causata dall’apertura del poro in seguito a deprivazione di nutrienti è diminuita. Nella seconda parte del mio lavoro mi sono focalizzata su una sindrome che predispone i pazienti all’insorgenza di tumori, la Neurofibromatosi di tipo 1, causata da perdita di funzione della neurofibromina, un regolatore negativo della via di segnale dominata da Ras. Ho studiato la possibilità che l’iper-attivazione della via di Ras dovuta all’inattivazione della neurofibromina possa modificare la bioenergetica mitocondriale, contribuendo così a cambiamenti metabolici in tumori di pazienti con NF1. Ho osservato che l’assenza della neurofibromina in fibroblasti embrionali di topo (MEFs) conferisce la capacità di formare colonie in un saggio tumorigenico in vitro, mentre il trattamento con un inibitore di ERK inibisce la formazione delle colonie in modo significativo. Inoltre, ho iniettato queste cellule sotto cute in topi nudi al fine di testare il loro potenziale tumorigenico in vivo. Ho osservato che l’assenza di neurofibromina porta alla crescita di una massa tumorale nell’arco di un mese dall’iniezione, mentre non si osservano masse tumorali nel caso di cellule wild-type. Ho iniziato l’analisi del profilo bioenergetico mitocondriale misurando il consumo di ossigeno in cellule adese ed ho osservato che cellule senza neurofibromina presentano un diminuito tasso di respirazione basale, oltre che una minore respirazione massima raggiunta dopo trattamento con basse concentrazioni di un disaccoppiante. Inoltre, la frazione di respirazione accoppiata alla produzione di ATP da parte dell’ATP sintasi è minore nelle cellule senza neurofibromina, suggerendo che le richieste energetiche sono principalmente a carico della glicolisi. In accordo a questi dati, in seguito a deplezione di glucosio o all'inibizione della glicolisi con 5-tioglucosio le cellule assenti della neurofibromina presentano un maggiore calo nei livelli di ATP rispetto a cellule wild-type. Le differenze del consumo di ossigeno, inoltre, non sono dovute a cambiamenti nella massa mitocondriale o nel potenziale di membrana. Al fine di determinare se possibili differenze nell’attività della catena respiratoria siano la causa di una diversa respirazione, ho analizzato l’espressione proteica di diverse subunità dei complessi respiratori. Il complesso I (NADH deidrogenasi) è diminuito in seguito alla deplezione della neurofibromina, così come la sua attività. Inoltre, la repressione farmacologica di ERK in cellule knock-out è in grado di aumentare specificatamente l’espressione delle subunità del complesso I, e quindi la sua attività; al contrario, questo effetto è meno forte nelle cellule wild-type. Ho osservato anche una diminuita attività del complesso II (succinato deidrogenasi) nelle cellule knock-out. Inoltre, ho trovato un’interazione tra il complesso II, lo sciaperone mitocondriale TRAP1 e la chinasi ERK, una frazione della quale è stata trovata nei mitocondri; queste interazioni sono molto più forti nelle cellule knock-out rispetto a quelle wild-type. Tuttavia, il silenziamento di TRAP1 non causa una variazione dell’attività del complesso II, bensì un’aumentata respirazione massima nelle cellule senza neurofibromina. Inoltre, la diminuita espressione di TRAP1 causa la perdita del potenziale tumorigenico delle cellule knock-out. Questi risultati suggeriscono che l’assenza della neurofibromina porta ad un fenotipo glicolitico con una diminuzione della respirazione mitocondriale. Questo cambiamento metabolico è tipico delle cellule tumorali poiché favorisce la progressione tumorale. Abbiamo quindi ipotetizzato che i cambiamenti metabolici causati dall’iper-attivazione della via di segnale Ras-ERK possano contribuire al fenotipo trasformante che abbiamo osservato nelle cellule senza neurofibromina.