Valutazione di ceppi mutanti di S. TYPHIMURIUM e di M. GALLOPROVINCIALIS come sistemi per la caratterizzazione tossicologica di nanoparticelle di ampio utilizzo

4 Nonostante il rapido sviluppo e il molteplice utilizzo di una varietà di nanoparticelle e nanomateriali, a tutt‟oggi mancano regolamentazione adeguata e protocolli standard per la loro caratterizzazione tossicologica. In questi anni, il centro di ricerca ECSIN (The European Centre for the Sustainable Impact of Nanotechnology) si è fatto promotore di studi in vitro e in vivo volti ad accertare i rischi biologici associabili a NP di ampio uso industriale, definendo tra gli altri obiettivi la valutazione di specifiche NP in cellule procariotiche ed eucariotiche. Benchè i batteri siano incapaci di endocitosi, alcuni dati conflittuali e la frammentarietà delle informazioni disponibili all‟inizio di questo studio hanno indotto a considerare come potenziale sistema bersaglio cellule derivate da S. thyphimurium LT2, mutanti rfa caratterizzati da sintesi difettiva delle catene polisaccaridiche dell‟LPS, lipopolisaccaride di membrana. Le Ludox® sono NP di silice di ampio utilizzo e di interesse prioritario in ECSIN. Esse vengono usate nella chiarificazione delle bevande e come additivi in polimeri, vernici, rivestimenti e detergenti per la loro capacità di migliorare le proprietà di resistenza, brillantezza e adesione delle superfici e recentemente in prodotti cosmetici. Ludox® AS 30 e SM 30, caratterizzate per diametro dinamico e potenziale zeta, sono state incubate con cellule TA 98 e TA 100 per 30 minuti in soluzione salina tamponata a 37°C. Rispetto alle NP come tali, quelle sottoposte ad ultrafiltrazione sono risultate meno citotossiche. Saggiate per attività mutagena sugli stessi ceppi (plate incorporation test) le Ludox® sono risultate innocue, indipendentemente dalla presenza della frazione microsomiale S9. Per una valutazione più esauriente, le NP AS 30 e SM 30 sono state saggiate anche in micropiastra (Ames fluctuation test) e nell‟SOS/ umu test, saggi che hanno confermato l‟incapacità di indurre, rispettivamente, mutazioni o danno al DNA. Per accertare se anche le cellule LPS-difettive escludessero le NP sono state applicate altre tecniche sperimentali. NP elettrondense quali Qtracker®800 e maghemite (γ Fe203) sono state incubate con le cellule TA 100 per 30 minuti e per 6 ore procedendo quindi a visualizzarle al TEM, analisi che hanno dimostrato l‟esclusione di entrambe le NP. Dati ottenuti in citometria a flusso incubando NP di silice marcate con fluoresceina oppure Qtracker®800 con cellule TA 100 in PBS a 37°C per 0.5-24 ore hanno rivelato una percentuale molto modesta di cellule fluorescenti. 5 A compendio del lavoro svolto, e per suggerire un uso alternativo dei test sopra illustrati, è stata valutata l‟interazione tra NP (γ Fe203) e ioni cromato (K2Cr2O7). L‟incubazione in PBS di maghemite e bicromato di potassio in dosi combinate ha dimostrato che le nanoparticelle causano una significativa attenuazione dell‟attività mutagena del cromo esavalente. Come approccio sperimentale alternativo, è stata messa a punto l‟analisi di danno al DNA in emociti di Mytilus galloprovincialis, un invertebrato marino già ampiamente usato come organismo sentinella dell‟ambiente costiero e che sta emergendo come modello anche per lo studio dell‟immunità innata. I primi risultati ottenuti con le particelle Ludox® indicano un aumento di frammentazione del DNA negli emociti trattati rispetto al controllo, più accentuato per le SM 30 rispetto alle AS 30. L‟individuazione di danno genetico in cellule di mitilo è stato consolidato ottimizzando l‟analisi della frequenza di cellule micronucleate come indice di danno cromosomico.