Bivalves coping with environmental changes: nanoparticles as a new potential stressor in coastal ecosystems

A livello dell’ambiente marino costiero, gli organismi sono soggetti a continue pressioni di diversa natura. Tra queste, valutate potenzialmente dannose per le biocenosi, si possono considerare le variazioni dei parametri ambientali, quali la temperatura, il pH, l’ossigeno disciolto, la salinità, e il rilascio di inquinanti. Dal secolo scorso, il crescente impatto di questi cambiamenti ambientali è stato causato principalmente dalle attività antropiche. Anche se questi cambiamenti sono spesso percepiti come distanti (per esempio, quelli relativi ai cambiamenti climatici) o minimi (ad esempio, la presenza di sostanze inquinanti), il loro impatto sull'ambiente marino è già evidente. Quotidianamente vengono rilasciati in ambiente nuovi inquinanti di origine antropica, definiti emergenti. Le informazioni sul loro comportamento nei diversi comparti ambientali (aria, acqua, sedimenti), le loro interazioni e gli effetti sulle popolazioni naturali sono scarse. Un vasto gruppo di contaminanti emergenti è rappresentato dalle nanoparticelle (NP). Le NP sono utilizzate ampiamente in varie tecnologie emergenti e prodotti commerciali, tra cui la biomedicina, i farmaci, i prodotti per la cura e l’igiene personale, le energie rinnovabili e i dispositivi elettronici. Di conseguenza le NP possono essere rilasciate nell’ambiente. In particolare, le NP possono entrare negli ecosistemi marini sia direttamente, attraverso la deposizione aerea, gli scarichi e gli effluenti, sia indirettamente, ad esempio, tramite la rete fluviale. Attualmente, non sono disponibili dati riguardanti le concentrazioni analitiche delle NP a livello dell’ambiente marino; questa è una conseguenza della difficoltà di rilevare e quantificare le NP in matrici complesse. A causa della mancanza di strumentazioni e protocolli efficaci per misurare le loro concentrazioni negli ambienti acquatici, in letteratura sono disponibili dati sulle concentrazioni ambientali previste delle NP (Predicted Environmental Concentrations, PEC). Tre delle NP maggiormente utilizzate in prodotti di largo consumo sono: l'ossido di zinco (nZnO), il biossido di titanio (nTiO2) e il fullerene C60 (FC60). La tossicità di queste tre NP è stata riportata per diversi taxa, come i batteri, le alghe, le piante, gli invertebrati acquatici e terrestri e i vertebrati. Tuttavia, gli studi riguardanti la potenziale tossicità di queste NP nelle specie marine sono ancora molto pochi. La vongola filippina, Ruditapes philippinarum, è stata scelta come organismo modello in questa tesi di dottorato, in quanto ampiamente utilizzata in molteplici studi ecotossicologici. Inoltre, i bivalvi sono considerati uno dei target più idonei per lo studio della tossicità delle NP, anche se le informazioni riguardanti gli effetti delle NP proprio in questa specie sono carenti. Essendo un organismo filtratore che vive nel sedimento, la vongola, rispetto ad altre specie, potrebbe essere più sensibile agli effetti delle NP, visto che le NP in acqua di mare tendono ad aggregare e di conseguenza a depositarsi sul fondo e accumularsi nei sedimenti. Lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di aumentare le informazioni e chiarire i possibili meccanismi d'azione e la tossicità di queste tre NP nella vongola filippina. Per raggiungere questo obiettivo, sono state allestite diverse esposizioni in laboratorio alle tre NP (nZnO, nTiO2, FC60) della durata di 7 giorni. Vari biomarker cellulari e biochimici sono stati misurati a livello dell’emolinfa, delle branchie e della ghiandola digestiva nella prospettiva di un approccio multi-biomarker. In questo studio, sono state scelte basse concentrazioni (1 e 10 µg/L) di NP simili ai valori di PEC. Inoltre, nei due esperimenti riguardanti le NP di ossido di metallo, il cloruro di zinco (10 µg/L) è stato utilizzato per indagare possibili contributi dello ione zinco nella tossicità del nZnO e, invece, la forma bulk del TiO2 (bTiO2, 10 µg/L) è stata utilizzata per comprendere la potenziale differente azione dell’ossido di metallo rispetto alla corrispondente NP. In ambiente gli organismi sono generalmente esposti a miscele di diverse sostanze inquinanti, per questo si è deciso di indagare l'effetto combinato di una miscela di tutte e tre le NP considerate. Per valutare gli effetti della miscela di NP, le vongole sono state esposte per 7 giorni a i) 1 µg/L di nZnO, ii) 1 µg/L di nTiO2, iii) 1 µg/L di FC60 fullerene e iv) tutte e tre le NP in miscela. In questo esperimento è stata utilizzata la proteomica redox combinata all'approccio multi-biomarker. Inoltre, sono stati studiati in un ulteriore esperimento gli effetti combinati della miscela di NP e di un parametro ambientale; per ottenere informazioni su eventuali variazioni della suscettibilità delle vongole alle NP in un possibile scenario di cambiamento globale. La salinità è uno dei fattori ambientali che controlla la distribuzione delle specie e influenza i processi fisiologici negli organismi marini. Tra i cambiamenti previsti dei vari parametri ambientali, vi è una crescente preoccupazione per le future alterazioni nei valori di salinità, soprattutto a livello degli estuari e delle zone costiere, dove potrebbero influenzare la sopravvivenza di specie autoctone e invasive. Inoltre, la salinità è uno dei parametri abiotici in grado di modificare il comportamento delle NP. In questo contesto, per ottenere una migliore comprensione dei potenziali impatti ambientali, è stata impiegata anche la specie autoctona, Ruditapes decussatus. In tutti gli esperimenti, è stato misurato il contenuto delle NP, sia nelle branchie sia nella ghiandola digestiva della vongola, per valutare il loro possibile bioaccumulo. Inoltre, per avere una visione più completa degli effetti del nTiO2 a livello cellulare, è stato utilizzato anche un approccio in vitro. I risultati hanno confermato la capacità del nTiO2 di entrare nelle cellule e di influenzare negativamente parametri legati alla risposta immunitaria. I risultati di tutti questi esperimenti hanno suggerito che le NP modulino varie risposte degli animali e hanno mostrato diversi effetti sub-letali nei tessuti della vongola. In particolare, gli esperimenti riguardanti gli effetti delle singole NP hanno mostrato condizioni di stress significativamente maggiori nelle branchie e nella ghiandola digestiva delle vongole. I tessuti analizzati hanno risposto diversamente alle tre NP, e tra loro la nTiO2 ha esercitato maggiori effetti negativi in tutti e tre i tessuti analizzati. Questo risultato potrebbe essere determinato dal metallo in sé, e dalle caratteristiche del nTiO2, che, per esempio, potrebbero facilitare l'entrata della NP nelle cellule. Lo stress ossidativo è stato confermato essere il principale meccanismo d’azione delle tre NP indagate, come riportato in letteratura. I confronti tra le NP di ossido metallico e i loro contaminanti correlati evidenziano come le NP siano più tossiche e questo dipende dalle caratteristiche specifiche delle NP. Nelle vongole esposte alle tre NP i contenuti di zinco, titanio e FC60 hanno mostrato, alla fine dell'esposizione, un aumento nei trattati rispetto ai controlli ad entrambe le concentrazioni testate. L’esperimento sulla miscela delle NP rappresenta un nuovo approccio in grado di fornire una migliore comprensione degli impatti delle NP in condizioni ambientali più realistiche. Rispetto ai risultati delle singole NP, tutti i dati ottenuti dall'esposizione delle vongole alla miscela indicano un maggiore stress ossidativo in atto, con conseguenti danni osservati alle proteine, ai lipidi e al DNA. La ghiandola digestiva risulta essere il tessuto più colpito dalla tossicità della miscela di NP. Inoltre, per tutti i parametri variati nei trattati rispetto al controllo, sono stati osservati effetti additivi nel trattamento con miscela rispetto a quelli con le singole NP. L'azione additiva riscontrata per la miscela potrebbe aprire nuovi filoni di ricerca utili a comprendere meglio i diversi meccanismi d’azione delle NP. I contenuti di Zn, Ti e FC60 quantificati anche in questo esperimento hanno evidenziato un bioaccumulo sia come singole NP, sia come miscela nelle branchie e nelle ghiandole digestive delle vongole esposte rispetto ai controlli. L’ultimo esperimento, riguardante l’interazione tra diversi valori di salinità (18-28-38 psu) e la miscela delle tre NP, conferma anche a queste condizioni la tossicità delle NP. In generale, a tutti i valori di salinità testati sono stati mostrati vari cambiamenti, in base al tessuto, ai biomarker e alla specie considerata. Il confronto tra le due specie non ha consentito di ricavare per ognuna di esse un chiaro modello di risposta alle diverse combinazioni salinità/assenza-presenza di NP saggiate. Anche se è necessaria una valutazione più approfondita, si è potuto notare tuttavia che il numero di risposte significativamente variate in presenza di miscela di NP era leggermente maggiore in R. decussatus rispetto R. philippinarum. Nel complesso, i risultati ottenuti sono in grado di fornire nuovi spunti di discussione negli studi sulla tossicità sulle NP, come pure nella valutazione del rischio, costituito dalle NP come inquinanti ambientali emergenti, negli ecosistemi marini costieri.