Alterata regolazione dei componenti della matrice extracellulare (ECM) e delle caveole negli adipociti invecchiati:studio in vitro ed ex vivo.

Aging is associated with dysfunction of adipose tissue with altered secretion of cytokines and proinflammatory chemokines and an increase in the seecretory phenotype associated with senescence (SASP). It has been shown that the increase of collagen I-VI expression by hypertrophic and dysfunctional adipocytes contributes to increasing the fibrosis of the extracellular matrix (ECM), worsening the dysfunction of the adipocytes themselves. Aging is also associated with hypoxic tissues and it is known that hypoxia itself can also determine the development of fibrosis in different tissues. Furthermore, in other cell types (such as monocytes and pulmonary epithelial cells) it has been described that reduced expression of caveolein 1 can be linked to an inflammatory state, increase in collagen deposition and fibrosis. Therefore, the aim of this study was to evaluate fibrosis and caveolae markers in an in vitro model of aging adipocyte cultured in standard conditions and after hypoxic stimulation. Furthermore, we tried to study the "fibrosis-caveole" relationship in epicardial adipose tissue (EAT) samples of subjects with and without coronary atherosclerosis (CAD and not-CAD). In our in vitro model, 3T3L1 mature (PID 10) and aged (PID 18) adipocytes have been studied; furthermore, as a premature aging model, the effects of a severe hypoxic stimulus in mature PID 10 adipocytes have been studied. A significant increase in the number of senescent cells, an increase in p53 protein and a decrease in SIRT protein 1 in both 3T3L1 mature adipocytes under hypoxic condition (PID 10 HYPO adipocytes) and aged 3T3L1 adipocyte (PID 18 adipocytes) were detected by the β-Galactosidase assay and Western blot analysis. Furthermore, area of adipocytes and the average lipid content, analyzed by Oil Red O staining, increased during aging while in hypoxic conditions they decreased significantly. PID 10 HYPO adipocytes and PID 18 adipocytes also showed a significantly greater accumulation of intracellular ROS than the related controls (p <0.001). Furthermore, it was found, by Real-Time analysis, that the expression of the genes coding for adiponectin and Caveolin1 was reduced while the expression of genes coding for proinflammatory cytokines (IL 6) and for ECM components ( col1a1, col6a3, laminin4a, MMP11) was increased in aged adipocytes and in mature adipocytes subjected to hypoxia. The immunofluorescence analysis showed an increase in collagen VIa3 and a simultaneous significant reduction of Cav1 during aging of adipocyte and in hypoxic conditions. Furthermore, the Western Blot results demonstrated, following the reduction of Cav 1, a greater activation of ERK Pathway in the absence of any modulation for PI3k / AKT Pathway. Finally, it was found, using immunoistochemical analysis and Masson’s trichrome staining, a significant reduction (p <0.01) of the Cav1 expression, an increase of HIF1α positive and an increase in stromal fibrosis in EAT samples of CAD patients compared to not-CAD patients. In conclusion, given that our results on the analysis of human epicardial adipose tissue confirm the data obteined with the in vitro model and show an association between Caveolina1, stromal fibrosis and aging, our in vitro model of physiological aging and premature aging adipocytes could be potentially useful for testing the effects of different therapeutic approaches aimed at reducing adipose tissue dysfunction and reducing pro-fibrotic and pro-inflammatory processes through the regulation of caveolae, thus leading to a improvement in terms of health and life.

L’invecchiamento si associa a disfunzione del tessuto adiposo con alterata secrezione di citochine e chemochine proinfiammatorie ed un aumento del fenotipo secretorio associato alla senescenza (SASP). E’ stato dimostrato che l’aumento dell’espressione dei collageni I-VI da parte degli adipociti ipertrofici e disfunzionali contribuisce ad aumentare la fibrosi della matrice extracellulare (ECM), peggiorando la disfunzione degli adipociti stessi. L’invecchiamento, inoltre, si associa ad ipossia tissutale ed è noto che anche l’ipossia stessa può determinare lo sviluppo della fibrosi in diversi tessuti. Inoltre, in altri tipi di cellule (come monociti e cellule epiteliali polmonari) è stato descritto che l'espressione ridotta della caveolina 1 può essere collegata ad uno stato infiammatorio, ad un aumento della deposizione di collagene ed alla fibrosi. Pertanto, lo scopo di questo studio è stato quello di valutare i marker di fibrosi e delle caveole in un modello sperimentale in vitro d’invecchiamento degli adipociti in condizioni standard e dopo stimolo ipossico. Inoltre, abbiamo cercato di studiare la relazione "fibrosi-caveole" in campioni di tessuto adiposo epicardico (EAT) di soggetti con e senza aterosclerosi coronarica (CAD e non CAD). Nel nostro modello sperimentale in vitro sono stati studiati adipociti 3T3L1 maturi (PID 10) e invecchiati (PID 18); inoltre come modello di invecchiamento precoce sono stati studiati gli effetti di uno stimolo ipossico severo in adipociti maturi a PID 10. È stato riscontrato, mediante il saggio della β-Galattosidasi ed analisi Western blot, un aumento significativo del numero di cellule senescenti, un aumento della proteina p53 e una diminuzione della proteina SIRT 1 sia negli adipociti maturi 3T3L1 sottoposti a condizione d’ipossia (adipociti HYPO PID 10) sia negli adipociti 3T3L1 invecchiati (adipociti PID 18). Inoltre, l'area degli adipociti e il contenuto lipidico medio, analizzati mediante colorazione Oil Red O, aumentavano durante l'invecchiamento mentre in condizioni ipossiche diminuivano significativamente. Gli adipociti PID 10 HYPO e gli adipociti PID 18 mostravano anche un accumulo significativamente maggiore di ROS intracellulari rispetto ai relativi controlli (p <0,001). Inoltre, mediante analisi Real-Time si è visto che l'espressione dei geni che codificano per l’adiponectina e la Caveolina1 era ridotta mentre l'espressione di geni codificanti per citochine proinfiammatorie (IL 6) e per componenti 4 ECM (col1a1, col6a3, laminin4a, MMP11) risultava aumentata in adipociti invecchiati ed in adipociti maturi sottoposti ad ipossia. L'analisi in immunofluorescenza ha mostrato un aumento del collageneVIa3 ed una contemporanea significativa riduzione di Cav1 durante l'invecchiamento degli adipociti ed in condizioni d'ipossia. Inoltre, le analisi di Western Blot hanno dimostrato parallelamente alla riduzione di Cav 1, una maggior attivazione di ERK Pathway in assenza di alcuna modulazione per PI3k / AKT Pathway. Infine, nei campioni di EAT di soggetti coronaropatici e non si osservava, dopo analisi immunoistochimica e dopo colorazione tricromica Masson, un aumento della fibrosi stromale, un aumento dei nuclei HIF1α positivi ed una riduzione significativa (p <0,01) dell'espressione di Cav1 nell' EAT dei pazienti CAD rispetto a non CAD. In conclusione, dato che i nostri risultati sull’analisi del tessuto adiposo epicardico umano confermano i dati nel modello in vitro e mostrano una associazione tra Caveolina1, fibrosi stromale e invecchiamento, il nostro modello in vitro d’invecchiamento fisiologico e d’invecchiamento precoce degli adipociti potrebbe essere potenzialmente utile per testare gli effetti di diversi approcci terapeutici finalizzati alla riduzione della disfunzione del tessuto adiposo ed alla riduzione dei processi pro-fibrotici e pro-infiammatori mediante l’up-regolazione delle caveole, portando così ad un miglioramento in termini di salute e della vita.