Synthesis and characterization of natural compounds derivatives for biological systems analysis: Topoisomerase I-DNA-camptothecin and protein kinase A-cyclic AMP complexes as case studies

Lo scopo del presente lavoro consta nell'analisi di due importanti enzimi: la Topoisomerasi I umana e la Protein Chinasi A. Le topoisomerasi sono un gruppo di enzimi deputati al controllo del superavvolgimento del DNA durante la fase di replicazione cellulare. La topoisomerasi I (sottoclasse B) espressa nell‟uomo e‟ in grado di rilassare il DNA attraverso il taglio di un singolo filamento ed il successivo scorrimento del filamento intatto senza consumo di ATP. Per il suo ruolo chiave nel controllo della replicazione cellulare la topoisomerasi e‟ stata presa in considerazione come possibile bersaglio per la cura di patologie implicanti una rapida (ed incontrollata) replicazione, quali le neoplasie. Tra gli inibitori più importanti di questo enzima, spicca sicuramente la camptotecina. Questa molecola svolge la propria azione stabilizzando il complesso binario DNA-enzima attraverso la formazione di un complesso ternario DNA-enzima-camptotecina. Il danno subentra quando avviene la collisione tra la forcella replicativa e il complesso ternario: il mancato riconoscimento tra i due sistemi sfocia nella successiva attivazione del programma di apoptosi. Uno degli aspetti più interessanti di questa molecola riguarda il suo meccanismo di azione. Per ottenere ulteriori informazioni abbiamo utilizzato la spettroscopia di risonanza di spin elettronico (ESR od EPR), dove viene eccitato e successivamente registrato lo spin dell‟elettrone. Sono stati dunque sintetizzati diversi derivati della camptotecina recanti una sonda paramagnetica (in questo caso, un nitrossido) e derivati nitrossido-marcati di una sequenza oligonucleotidica di DNA con un sito ad alta affinità per la topoisomerasi I. Vengono anche mostrati i saggi biologici realizzati per valutare la loro attività nei confronti dell’enzima. Le protein chinasi cAMP dipendenti (PKA) sono enzimi dipendenti dal secondo messaggero, il cAMP (3‟-5‟-adenosina monofosfato ciclico). Questi enzimi si presentano in forma di tetrameri composti de due subunità regolatorie (R) e due catalitiche (C); il cAMP lega le subunità regolatorie delle PKA e converte quest‟ultima nella conformazione attiva grazie alla quale è in grado di trasferire gruppi fosfato da una molecola donatrice quale l‟ATP a specifici substrati. Questo processo, definito fosforilazione, è alla base di numerosi processi metabolici cellulari, quali la trascrizione, il metabolismo, il ciclo cellulare, la differenziazione, la crescita, lo sviluppo e l‟apoptosi. Un’ incontrollata regolazione della PKA può portare all’ insorgenza di patologie gravi, tra cui anche il cancro. Uno studio recente condotto dall’Università di Padova ha infatti mostrato una anomala distribuzione di una della subunità regolatorie della PKA in cellule cerebrali affette da glioma. Per investigare più dettagliatamente questo aspetto, è stata realizzata una sonda basata sulla struttura AMP ciclica recante un fluoroforo facilmente misurabile quale la rodamina.