Skeletal muscle analysis by two different approaches: - an in vivo model to study the physiology of cellular prion protein - proteomics to identify biomarkers of illicit animal treatments

I dati riportati nella presente tesi sono stati ottenuti in due diversi progetti. Pertanto, la tesi è divisa in due distinti capitoli. Il primo capitolo, che si riferisce agli articoli I e II, riporta uno studio volto a chiarire il ruolo fisiologico della proteina prionica cellulare (PrPC) utilizzando un modello in vivo di rigenerazione del muscolo scheletrico. Il secondo capitolo si riferisce all'articolo III, in cui si è cercato di individuare possibili marcatori biologici di trattamento illecito di vitelloni con agenti promotori della crescita (GPA), utilizzando un approccio di elettroforesi bidimensionale (2DE), in combinazione con spettrometria di massa. Focalizzando l'attenzione sul rapporto tra PrPC e la rigenerazione del muscolo scheletrico in un modello in vivo, nella prima linea di ricerca (Capitolo I) abbiamo indagato se e come la proteina influenza la proliferazione e la differenziazione delle cellule precursori del muscolo. PrPC è una glicoproteina ancorata alla membrana esterna delle cellule coinvolta nella comparsa di malattie neurodegenerative rare e mortali, conosciute con il nome di encefalopatie spongiformi trasmissibili (EST) o malattie da prioni. L'evento alla base delle EST è la conversione della PrPC in una isoforma con una modificata conformazione che dà origine al prione, un agente infettivo neurotossico. Anche se ora sono disponibili molte informazioni sulle diverse vie di infezione da parte del prione, sia i meccanismi alla base della neurotossicità, sia il ruolo fisiologico della PrPC rimangono poco chiari. Tuttavia, l'uso di diversi modelli animali e cellulari ha suggerito molteplici funzioni putative per la PrPC, che vanno dalla protezione cellulare contro lo stress ossidativo e stimoli apoptotici, all'adesione, proliferazione e differenziazione cellulare. Il muscolo scheletrico esprime quantità significative di PrPC, e molti studi l'hanno correlato alla fisiopatologia della proteina. Pertanto, al fine di chiarire il ruolo fisiologico della PrPC in questo tessuto, abbiamo impiegato una protocollo di degenerazione/rigenerazione del muscolo tibiale anteriore, che ci ha permesso di confrontare il processo rigenerativo in topi che esprimono, o meno, PrPC. I parametri istologici e biochimici analizzati hanno fornito prove della rilevanza fisiologica della PrPC e del suo coinvolgimento negli eventi di segnalazione coinvolti nella rigenerazione muscolare. Infatti, è stato osservato che l'assenza della PrPC ritarda significativamente il processo di rigenerazione rispetto ai muscoli WT. In particolare, abbiamo trovato che la mancanza di PrPC causa un'attenuazione della via di segnalazione attivata dal TNF-alpha, che porta ad una ridotta attivazione della chinasi p38, e - conseguentemente - ritarda l'uscita dal ciclo cellulare e la differenziazione dei precursori miogenici. È importante sottolineare che il ripristino dell'espressione della PrPC abolisce completamente il fenotipo osservato nei muscoli di topi PrP-KO, sottolineando che la regolazione delle vie di segnalazione da parte PrPC ha una chiara importanza fisiologica anche in tessuti extraneuronali. La seconda linea di ricerca, descritta nel capitolo II, è stata volta a creare una strategia basata su tecniche di proteomica per l'identificazione di trattamenti farmacologici illeciti in vitelloni. L'approccio classico per la rilevazione di questa pratica illegale non è adatto ad individuare composti sia di struttura chimica sconosciuta, sia di farmaci presenti a livelli inferiori alla soglia di quantificazione delle tecniche analitiche attualmente impiegate. Il successo delle analisi istologiche di organi bersaglio, che vengono indirettamente modificati a seguito di questi trattamenti, ha suggerito che gli approcci basati sulla ricerca degli effetti biologici delle molecole in esame, piuttosto che sulla rilevazione diretta dei loro residui, potrebbero essere molto utili. Il vantaggio più rilevante di questa metodologia è che le modificazioni del tessuto indotte da un trattamento farmacologico rimangono evidenti molto tempo dopo la fine dei trattamenti illeciti, quando i residui chimici non sono più, o quasi, rilevabili. D'altra parte, questo approccio è notevolmente limitato dalla capacità di valutazione dei tecnici e l'analisi e influenzata dalla soggettività. Per questo, sono necessarie nuove strategie per il rilevamento dei biomarcatori indiretti presenti nei fluidi animali o nei tessuti. Questi biomarcatori possono essere molecole naturalmente presenti, come ad esempio proteine che abbiano subito modifiche nella struttura, o nella concentrazione, a seguito di variazioni della condizione fisiologica dell'animale. Per identificare tali marcatori biologici di trattamenti farmacologici illeciti nei bovini da carne, abbiamo adottato un approccio proteomico, mediante elettroforesi differenziale su gel in due dimensioni (2D-DIGE) e analisi in spettrometria di massa, al fine di confrontare i pattern di espressione proteica di muscolo scheletrico tra animali trattati farmacologicamente e di controllo. A questo scopo, i vitelloni appartenenti al gruppo di trattamento sono stati sottoposti a tre differenti protocolli farmacologici, mediante l'impiego di agenti promotori della crescita. Due di questi trattamenti hanno portato ad un notevole effetto anabolico rispetto agli animali non trattati, mostrando di conseguenza un'alterazione del proteoma del muscolo scheletrico. Le mappe proteiche dei campioni appartenenti ai gruppi di trattamento e di controllo sono state confrontate utilizzando il software DeCyder per analisi di dati derivanti da 2D-DIGE. Si è poi cercato di identificare, con un approccio di spettrometria di massa (MALDI) in tandem (MS/MS), tutte le proteine che mostrano una significativa alterazione nei loro livelli di espressione in seguito a somministrazione di agenti promotori della crescita. Tra le 169 proteine che cambiano in espressione in seguito al trattamento farmacologico, sono state identificate 29 proteine diverse, la maggior parte delle quali è coinvolta nella contrazione muscolare e nel metabolismo energetico. Questi risultati confermano i precedenti risultati sul meccanismo d'azione degli agenti promotori della crescita, e possono essere utili per sviluppare nuove strategie per l'identificazione di trattamenti farmacologici illeciti nei bovini da carne.