Functional characterization of AtTPK3 potassium channel of Arabidopsis thaliana

Il mio progetto di dottorato si è focalizzato sulla caratterizzazione, dal punto di vista biochimico ed elettrofisiologico, di una proteina denominata TPK3 che è predetta di funzionare come canale selettiva per il potassio (K+) ed essere localizzata nei cloroplasti nelle piante superiori,. Questa proteina appartiene alla famiglia dei canali TPK (da Tandem-Pore K+ channels) e mostra omologia di sequenza a un altro canale del K+ studiato nello stesso nostro laboratorio, denominato SynK (Zanetti et al., 2010), a localizzazione tilacoidale ed appartenente al phylum dei Cianobatteri. È stato dimostrato in più esperimenti che il canale SynK è fondamentale per la regolazione della fotosintesi nei Cianobatteri, in considerazione del fenotipo fotosensibile mostrato dai mutanti per il gene synk. Visto la localizzazione predetta del TPK3, è stato ipotizzato in partenza che TPK3 potesse svolgere un ruolo simile nelle piante superiori. Finora nulla si conosceva sulle proprietà di TPK3, ne sui suoi ruoli fisiologici, ne su di un suo eventuale coinvolgimento nella fotosintesi nelle piante superiori; il lavoro contenuto nel progetto presentato ha cercato di chiarire alcuni aspetti salienti delle funzioni di TPK3. Dopo studi di localizzazione subcellulare condotti con tecniche di biochimica e microscopia confocale, il canale TPK3 è stato espresso in E. coli per la successiva caratterizzazione elettrofisiologica in bilayer lipidico planare allo scopo di determinare la sua funzione come canale di K+. L’assenza di mutanti commerciali per il gene tpk3 ha necessitato la messa a punto del suo silenziamento tramite RNA interference del messaggero per la proteina suddetta, al fine di analizzarne i possibili ruoli fisiologici. Le piante silenziate risultanti, sottoposte a differenti condizioni di crescita, sono state studiate in vari esperimenti atti a determinarne vari parametri inclusi quelli fotosintetici. Contemporaneamente allo studio del TPK3, quello di maggior rilievo nel mio dottorato, ho seguito anche altri due filoni di ricerca principali, riguardanti l’uno l’approfondimento delle funzioni di due membri dei Recettori di Glutammato vegetali (GluRs) e l’altro la caratterizzazione degli omologhi del recentemente identificato MCU (Mitochondrial Calcium Uniporter) di Mammiferi. Nella presente tesi è inoltre incluso un manoscritto (Checchetto et al., 2012) per il quale ho collaborato nell’espressione eterologa del canale di K+ calcio-dipendente (SynCaK) di Cianobatteri.