Applicazione della spettrometria di massa nello studio delle pneumopatie ostruttive del bambino

Background e obiettivi Le pneumopatie ostruttive nel mondo, tra cui asma e bronco pneumopatia cronica ostruttiva (COPD), sono in continua crescita. Nel 2006 circa 46 milioni di persone erano affette da asma, di cui 9.5 milioni erano bambini; anche la COPD è in continuo aumento e, anche se l’incidenza cresce con l’età anagrafica, sembra che diversi fattori e malattie pregresse dell’infanzia, possano influenzare la funzionalità respiratoria dei soggetti e l’evolvere della patologia. Nonostante i molti studi condotti, i meccanismi alla base di queste malattie respiratorie non sono ancora del tutto chiariti, e necessitano pertanto di ulteriori indagini. La spettrometria di massa, tecnica analitica sensibile e robusta, trova sempre più applicazioni in ambito clinico-diagnostico, grazie alla capacità di determinare i metaboliti presenti nei campioni biologici dai valori di massa o identificarne la struttura tramite frammentazione con caratteristiche di estrema sensibilità, specificità e selettività. La possibilità di analisi di miscele complesse, grazie all’accoppiamento con tecniche cromatografiche gassose o liquide, i tempi di analisi ridotti, l’identificazione qualitativa ma soprattutto i dosaggi quantitativi anche di numerosi biomarcatori in una singola analisi, ha reso questa una tecnica di elezione per studi clinici. In particolare oltre al classico approccio target per quantificare specifici composti già noti o che si suppone siano caratteristici di una patologia, negli ultimi anni si è sviluppato un nuovo tipo di approccio untargeted, noto come “metabolomica”, che vede lo studio dell’intero profilo metabolico di un campione biologico, attraverso tecniche analitiche altamente sensibili e ad elevata capacità, quali la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HMS). Tramite questo approccio è possibile caratterizzare il profilo metabolico generale di un gruppo di soggetti con una determinata patologia rispetto ad un gruppo di controllo ed estrapolare le variabili discriminanti, grazie a tecniche statistiche di tipo multivariato. L’analisi untarget, non basata su ipotesi a priori, può aprire la strada a nuove ipotesi eziopatologiche oltre ad aiutare nell’identificazione di biomarkers diagnostici e prognostici. Obiettivo di questo dottorato era studiare le pneumopatie ostruttive in età pediatrica mediante l’applicazione di entrambi questi approcci, su campioni di urine o condensato di aria espirata (EBC). L’EBC è un biofluido che, data la sua raccolta assolutamente non invasiva, costituisce una matrice biologica ideale per studi di questo tipo, ma essendo la concentrazione dei metaboliti estremamente bassa, risulta al tempo stesso una matrice analiticamente complessa. Metodi e risultati Nel primo studio, l’analisi metabolomica HMS dell’EBC è stata impiegata per indagare il profilo biochimico-metabolico degli EBC di adolescenti con diagnosi di broncodisplasia alla nascita (BPD) rispetto a quello di un gruppo di adolescenti sani. I campioni sono stati analizzati con lo spettrometro di massa LTQ-OrbiTrap e processati tramite analisi statistica multivariata. I risultati ottenuti hanno mostrato che è possibile discriminare il gruppo BPD dal gruppo di controllo attraverso la caratterizzazione dei campioni di EBC, ottenuta con un modello OPLS-DA robusto (R2:0.95, Q2:0.82 ), mostrando un differente profilo biochimico-metabolico negli adolescenti con BPD alla nascita. L’individuazione di glicerofosfolipidi, tra le variabili discriminanti, ha suggerito un possibile coinvolgimento del surfattante alveolare alla base della minore funzionalità respiratoria dei soggetti con BPD, anche dopo anni dalla fase acuta della malattia. Il secondo studio ha previsto l’utilizzo della metabolomica HRMS per ottenere una prima caratterizzazione biochimica-metabolica dei bambini con broncospasmo ricorrente o wheezing in età prescolare, in vista di uno studio prospettico per valutare quali di questi bambini svilupperà asma con la crescita, e considerare a posteriori se esistano dei biomarkers prognostici. I risultati preliminari di questa parte dello studio sono stati promettenti: grazie all’analisi di campioni di urina con lo spettrometro di massa ibrido Q-TOF associato ad UPLC, si è ottenuta une netta differenziazione dei soggetti con wheezing rispetto ai bambini sani, mediante un modello OPLSA- DA. L’analisi preliminare ha permesso di ottenere una netta separazione tra bambini con wheezing e bambini sani, mettendo in evidenza alcune molecole discriminanti. Lo studio è ancora in corso in quanto prevede la valutazione degli stessi soggetti a 18 e 36 mesi. La terza parte dello studio relativa all’utilizzo della MS target prevedeva la valutazione e quantificazione di alcuni indicatori di stress ossidativo in campioni di EBC di soggetti asmatici. È stato sviluppata e validata una metodica UPLC-MS/MS per l’analisi quantitativa di dimetilarginine, ADMA e SDMA, in campioni di EBC. L’analisi è stata condotta tramite tecnica MRM in spettrometria di massa quadrupolare associata ad UPLC, con sistema di arricchimento on-line del campione. Il sistema analitico è risultato robusto (r2>0.992, %Bias <3% intra- CV% inter-intra assay =20%, recovery% tra 97 e 102%), rapido (corsa cromatografica di 5 minuti), e sensibile, adatto anche ad analisi di campioni biologici diluiti quali gli EBC. La quantificazione di tali metaboliti condotta su campioni di bambini asmatici e sani, ha mostrato un aumento di ADMA negli EBC dei soggetti asmatici, indicando un ruolo dell’ADMA nel danno tissutale delle vie aeree tipico dell’asma bronchiale. Conclusioni Questa ricerca ha dimostrato che la spettrometria di massa ad elevata sensibilità strumentale, grazie alla quale è stato possibile ottenere informazioni significative anche da piccole quantità di campione e da matrici estremamente diluite, può essere applicata con buoni risultati alla studio di pneumopatie ostruttive, rendendo più facili studi di follow up, oltre che aiutare il medico nell’individuare possibili marcatori utili alla la diagnosi e/o nuovi target terapeutici.