Identification and Characterization of FoxO-target genes by Chromatin Immunoprecipitation

RIASSUNTO: Diverse patologie sistemiche, quali il diabete la sepsi, la cachessia neoplastica, e condizioni cataboliche, come la denervazione, l’immobilitazione, i trattamenti con glucocorticioidi o digiuno, portano conseguenza sono caratterizzate dalla perdita di massa muscolare, definita come atrofia muscolare. Questa perdita di massa muscolare è dovuto all’aumento dell’attività di sistemi proteolitici, come il sistema dell’ubiquitina-proteosoma e il sistema autofagico-lisosomiale. Studi di espressione genica hanno evidenziato l’esistenza di un gruppo comune di geni, sovra espressi o repressi in molte condizioni atrofiche. Questi geni sono stati chiamati geni dell’atrofia o atrogenes (Jagoe and Goldberg, 2001; LECKER et al., 2004). Tra questi spiccano due geni, MuRF-1 and atrogin-1, altamente espressi in molte condizioni atrofiche, che codificano per due ubiquitine ligasi muscolo specifiche. L’induzione induzione di atrogin-1 and MuRF-1 precede la perdita di massa muscolare e continua per tutto il processo. L’identificazione di queste due ubiquitine ligasi tra i geni dell’atrofia è importante in quanto esse costituiscono il la componente limitante del processo di ubiquitinizzazione, e, quindi, sono cruciali per la regolazione della degradazione proteica dipendente dal proteasome (Gomes et al., 2001). Atrogin-1 è regolato dai fattori trascrizionali FoxO che sono a loro volta inibiti dalla via di segnale di IGF1-PI3K-Akt. L’assenza di stimoli della crescita, come IGF1 o l’insulina, rende AKT non attivo e quindi non in grado di bloccare i fattori FoxO, che possono traslocare nel nucleo e interagire con i promotori dei geni bersaglio (Sandri et al., 2004). Nel tessuto muscolare dei mammiferi sono espressi tre fattori FoxO: FoxO1, FoxO3 and FoxO4, caratterizzati da un “forkhead box”, che comprende il dominio di legame con il DNA. I fattori FoxO riconoscono e legano, come monomeri, una stessa sequenza consensus sul DNA. Precedenti studi hanno dimostrato che FoxO1 e FoxO3 sono coinvolti nell’atrofia muscolare (Kamei et al., 2004; Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). Non sono ancora stati resi noti quali siano i geni controllati dai entrambi i fattori FoxO o in modo specifico da uno dei due, che determinano la perdita di massa muscolare. L’identificazione di geni bersaglio dei FoxO è oggetto di numerosi studi, dato il coinvolgimento di questi fattori nel regolare svariate funzioni cellulari. Nell’ottica di comprendere in vivo l’interazione tra i FoxO e promotori dei geni bersaglio, ho applicato la tecnica della Chromatin immunoprecipitatetion (Das et al., 2004). Questa tecnica combina la specificità dell’immunoprecipitazione, per purificare proteine di interesse, con la potenza della reazione della PCR, per amplificare sequenze genomiche potenzialmente legate alla proteina studiata. Ho iniziato con l’analisi dell’interazione di FoxO1 e FoxO3 con una regione promotore di atrogin-1 contenente 14 siti potenziali per il legame di FoxO. Dopo una prima serie di esperimenti in virto per verificare l’efficienza della ChIP nel rilevare i legami dei fattori FoxO con il DNA, sono passata a studi in vivo, prima in condizioni di sovra espressione dei fattori FoxO e successivamente in un modello di atrofia. Mediante elettroporazione in muscoli tibialis anteriori di topi CD1, ho indotto l’espressione delle forme costitutivamente attive di FoxO1 e FoxO3 entrambi con all’epitopo HA. Dopo 7 giorni dall’operazione, i muscoli sono stati prelevati, lisati e trattati per essere utilizzati in esperimenti di ChIP. A seguito d’immunoprecipitazione, i frammenti di cromatina legati ai fattori FoxO sono stati amplificati mediante PCR utilizzando primer specifici per i 14 i siti potenziali di legame sul promotore di atrogin-1. Da questi esperimenti è emerso che FoxO3 si lega in molti siti sul promotore di atrogin-1, mentre per FoxO1 ho individuato una debole interazione su un unico sito. Per comprendere meglio quali siti sono fisiologicamente rilevanti nella regolazione di atrogin-1, ho analizzato l’interazione FoxO-promotore di atrogin-1 durante l’atrofia. Come modello di atrofia è stato scelto il digiuno, modello in cui c’è una notevole attivazione dei fattori FoxO e un incremento dell’espressione di atrogin-1 di circa 10 volte, rispetto alla condizione di controllo. Ho utilizzato per studi di ChIP il lisati muscolari di topi a 24 ore di digiuno e di topi di controllo. Questa serie di studi di ChIP hanno dimostrato che, durante il digiuno, FoxO3 lega in modo preferenziale tre regioni del promotore di atrogin-1, in cui aumentano i livelli di acetilazione della cromatina. L’analisi per FoxO1 rilevato solo una debole interazione di FoxO1 su una regione del promotore di atrogin-1. Per indagare la capacità di entrambi i fattori FoxO nel promuovere la trascrizione del gene, indipendentemente dal legame al promotore, ho utilizzato il sistema del gene reporter luciferasi fuso al promotore di atrogin-1. Dall’analisi al luminometro è emerso che FoxO3 promuove fortemente l’attività promotoriale, mentre FoxO 1 non ha alcuna capacità di transattivare atrogin-1. Questi risultati hanno suggerito il coinvolgimento di altri geni regolati dai FoxO nel programma atrofico. Come conferma di questa ipotesi è stato osservato che la sovra-espressione di atrogin-1 per sè non è sufficiente a indurre la perdita di massa muscolare. Ho preso in esame altri due geni del gruppo degli atrogenes, LC3 e Bnip3, compresi tra il gruppo degli atrogenes maggiormente indotti. Entrambi appartengono al sistema dell’autofagia mediata dai lisosomi. Le rispettive proteine codificate, LC3 and Bnip3, costituiscono due componenti cruciali per la formazione degli autofagosomi, strutture vescicolari deputate alla degradazione di porzioni citoplasmatiche. L’analisi dei promotori di LC3 e Bnip3 ha evidenziato molti siti potenziali per l’interazione con i fattori FoxO. Gli esperimenti condotti di ChIP hanno dimostrato che in condizioni di digiuno FoxO3 lega regioni specifiche di questi promotori. Gli studi funzionali dell’attività promotoriale hanno confermato che il legame di FoxO3 con il promotore li LC3 è essenziale per attivare la trascrizione del gene. Inoltre, mediante l’espressione di FoxO3 costitutivamente attivo e del dominante negativo, è emerso che FoxO3 regola i livelli proteici di Bnip3. Tuttavia questi risultati non hanno chiarito ancora quali sono i geni regolati da FoxO1 e se ci sono altri atrogenes controllati da FoxO3. Nell’obiettivo di estendere gli studi d’interazione proteina-DNA a più regioni promotori del genoma, è stato scelto di applicare la tecnica della ChIP on Chip. Questa tecnica combina la ChIP con l’ibridazione su microarrays genomici. Gli esperimenti di ChIP on Chip sono stati condotti in colture cellulari, utilizzando miotubi infettati con adenovirus esprimenti la forma costitutivamente attiva di FoxO3 con l’epitopo HA. I risultati ottenuti hanno messo in evidenza che FoxO3 interagisce con i promotori di geni che apprtengono a diverse vie del segnale e sono implicati in importanti processi metabolici e nella regolazione trascrizionale. E’ stato interessante notare che tra i promotori genici bersaglio di FoxO3 otto di questi sono promotori di atrogenes. Dall’analisi dei livelli di espressione di alcuni di questi geni bersaglio, è emerso il ruolo chiave di FoxO3 nella loro regolazione. Il mio lavoro svolto durante il dottorato pone le basi tecniche per l’identificazione di geni fondamentali al programma atrofico e costituisce un contributo per lo sviluppo di nuove strategie farmacologiche contro la perdita di massa muscolare.