Role of Autophagy in the control of muscle mass

Nel muscolo scheletrico, la degradazione proteica è principalmente mediata da due sistemi altamente conservati: il sistema ubiquitina-proteasoma e il sistema autofagico-lisosomiale. Nel sistema ubiquitina-proteasoma, le proteine destinate alla degradazione vengono poli-ubiquitinate e successivamente veicolate e degradate nel proteasoma. Tale sistema è costitutivamente attivo nel normale muscolo scheletrico ed è responsabile per il riciclo di proteine muscolari solubili e proteine miofibrillari (Lecker et al., 2006; Mammucari et al., 2007). Nel sistema autofagico-lisosomiale, porzioni citoplasmatiche e organelli vengono sequestrati all’interno di vescicole (autofagosomi), i quali successivamente si fondono con i lisosomi (Lum et al., 2005). Anche tale sistema è costitutivamente attivo nel muscolo scheletrico. Il sistema ubiquitina-proteosoma è costitutivamente attivo nel muscolo, però la sua attività aumenta in maniera significativa durante l’atrofia muscolare, dovuto all’attivazione di due ubiquitine-ligasi: Atrogin-1/Mafbx e Murf1 (Gomes et al., 2001). L’attivazione di questi due geni è regolata dal fattore di trascrizione FoxO3. Tale fattore è normalmente fosforilato e inattivo quando la via di segnale AKT/PKB è attiva; di contro quando tale via è repressa (ad esempio durante l'atrofia muscolare) il fattore di trascrizione può traslocare nel nucleo dove può attivare la trascrizione dei suoi geni target (Sandri et al., 2004; Stitt et al., 2004). Durante l’atrofia muscolare indotta da diverse condizioni debilitanti (ad esempio: digiuno e diabete), vi è l’attivazione di diversi geni, comunemente chiamati “Atrogenes” e i più indotti sono le due ubiquitine-ligasi Atrogin-1 e Murf-1. Tra questi “Atrogenes” fanno parte anche geni correlati all’autofagia. Questi geni sono: LC3, GABARAP e BNIP3. Durante la prima parte del mio dottorato di ricerca, ci siamo concentrati sulla regolazione trascrizionale dei geni dell’autofagia. La nostra ipotesi era che FoxO3 potesse regolare sia il sistema ubiquitina-proteasoma sia il sistama autofagico-lisosomiale a livello del muscolo scheletrico. Per caratterizzare i meccanismi che regolano il sistema autofagico durante l'atrofia muscolare in vivo, abbiamo analizzato se la via di segnale Akt/mTOR fosse coinvolta nella regolazione di alcuni geni autofagici. Durante l’atrofia muscolare indotta dal digiuno e dalla denervazione, abbiamo osservato che tali geni sono indotti (Mammucari et al., 2007). Comunque l’induzione di questi geni sono inibiti quando la via di segnale Akt è attiva e inoltre l’attivazione acuta di tale sistema, mediante l’utilizzo dei topi transgenici per Akt, inibisce il sistema autofagico durante l’atrofia muscolare. Inoltre, abbiamo osservato che la via di segnale mTOR non sembra svolgere un ruolo significativo nella attivazione della via autofagica-lisosomiale durante l'atrofia muscolare. Infatti la regolazione di geni autofagici e la formazione delle vescicole autofagiche non erano indotte sia in seguito al trattamento degli animali con il farmaco rapamicina (inibitore di mTOR), sia abbattendo mTOR. Questi risultati sono in accordo con studi precedenti (Kochl et al., 2006; Mordier et al., 2000; Sarkar et al., 2007; Yamamoto et al., 2006). Per capire il ruolo di FoxO3 nella regolazione del sistema autofagico-lisosomiale, ci siamo avvalsi di diverse metodiche sperimentali che consistevano nella gain/loss function. Tali esperimenti ci hanno permesso di identificare due nuovi geni bersaglio per Foxo3, i quali sono coinvolti nella regolazione dell’autofagia. Questi geni sono LC3 e Bnip3. L’analisi dei promotori di LC3 e Bnip3 ha evidenziato alcuni potenziali siti per l’interazione con il fattore di trascrizione FoxO3. Mediante l’utilizzo della metodica ChIP (Chromatin–ImmunoPrecipitation) abbiamo dimostrato che FoxO3, durante condizioni di atrofia, si lega in siti specifici dei promotori. Per validare queste osservazioni abbiamo condotto degli studi funzionali e quindi le regioni di interazione FoxO3 sono state clonate a monte del gene della luciferasi. Questi studi funzionali hanno confermato che FoxO3 è in grado di indurre l’espressione dei geni LC3 e BNIP3. Ulteriori esperimenti di loss-function hanno inoltre documentato che l’induzione di BNIP3 è necessaria per l’attivazione dell’ autofagia nel muscolo scheletrico adulto. Infine ci siamo chiesti se l'induzione del sistema autofagico fosse un evento secondario o no rispetto all'attivazione del sistema ubiquitina-proteasoma. L'inibizione del sistema ubiquitina-proteasoma, mediante approccio farmacologico o genetico, non ha influenzato l'autofagia, suggerendo che le due vie di degradazione proteica siano controllate da FoxO3 in modo indipendente (Mammucari et al., 2007). Questo ha dimostrato che il fattore di trascrizione FoxO3 è in grado di regolare due diversi sistemi proteolitici nel muscolo scheletrico. Nella seconda parte del mio dottorato ci siamo concentrati sulla comprensione del ruolo del sistema autofagico basale nell'omeostasi del muscolo scheletrico. E’ noto che una eccessiva attivazione dell’autofagia induce una esacerbata atrofia muscolare, dovuta ad una sproporzionata eliminazione di porzioni citoplasmatiche, proteine ed organelli (Dobrowolny et al., 2008; Mammucari et al., 2007; Wang et al., 2005; Zhao et al., 2007). Di contro, l'inibizione del sistema, dovuto a difetti genetici degli enzimi lisosomiali o a farmaci che inibiscono la funzione lisosomiale, come la clorochina (Shintani e Klionsky, 2004), causa diverse miopatie come le malattie di Pompe e di Danon. Si pensa che l'inibizione del sistema autofagico giochi un ruolo in molte miopatie caratterizzate da inclusioni, o che presentano mitocondri anormali (Levine e Kroemer, 2008; Temiz et al., 2009). In ogni caso il ruolo specifico del sistema autofagico nel muscolo scheletrico non è stato determinato. Per comprendere il ruolo esatto del sistema autofagico nella fisiologia del muscolo scheletrico, abbiamo generato dei topi transgenici-condizionali, in cui è stato deleto il gene Atg7 specificatamente a livello del muscolo scheletrico. Quindi per tale scopo, topi transgenici Atg7flox sono stati incrociati con dei topi esprimenti l’enzima Cre-recombinasi, regolata da un promotore muscolo-specifico (Myosin Light Chain 1f). La proteina Atg7 è fondamentale per la formazione delle vescicole autofagiche, mediante l’attivazione di diverse proteine Atg, e per la formazione degli autofagosomi. La delezione del gene Atg7 induce una profonda atrofia muscolare, formazione di aggregati proteici che risultano essere positivi per la proteina p62/SQSTM1 e una diminuzione della forza muscolare che è correlata con l’età dell’animale. Inoltre mediante microscopia elettronica, abbiamo rilevato che tali animali presentano dei depositi di mitocondri anormali, distensione reticolo sarcoplasmatico, disorganizzazione del sarcomero, e la formazione di strutture membranose aberranti e concentriche. Per di più, la perdita muscolare è più accentuata nei topi durante la denervazione ed il digiuno. Questi risultati suggeriscono che il sistema autofagico nel muscolo scheletrico è importante per evitare la perdita di massa muscolare e per mantenere l'integrità delle miofibre. Inoltre l’inibizione di Atg7 ha mostrato l'attivazione di proteine chaperonine associate al reticolo endoplasmatico, in particolare la proteina BIP, così come la fosforilazione di eIF2α, fattore d’inizio della traduzione, suggerendo una continua attivazione delle vie implicate nella regolazione delle proteine mal formate. La presenza di proteine alterate nei topi transgenici induce stress del reticolo endoplasmatico, che può generare ROS, e la soppressione della sintesi proteica, che possono contribuire ad atrofia muscolare (Masiero et al., 2009). Per confermare i dati ottenuti nei topi transgenici-condizionali, abbiamo generato un altro tipo di topo transgenico tamoxifen-inducibile per Atg7 muscolo specifico. In questo caso i topi Atg7flox sono stati incrociati con dei topi esprimenti la Cre-recombinasi fusa con un recettore degli estrogeni modificato, sotto il controllo di un promotore muscolo-specifico (Human Skletal Muscle). In condizioni normali il gene Atg7 sarà espresso in tutti i tessuti perché, in assenza del ligando per gli estrogeni, la proteina di fusione è bloccata e inattivata a livello citoplasmatico da un complesso di Heat Shock Protein. Quando trattiamo gli animali con il Tamoxifen, un analogo degli estrogeni che presenta un’alta affinità per il recettore degli estrogeni modificato, il legame del composto determina il distacco del complesso delle Heat Shock Protein e la traslocazione della proteina di fusione nel nucleo, dove può esplicare la sua attività enzimatica. In questo modo, in seguito al trattamento con il Tamoxifen, si ottiene la delezione del gene Atg7 solo a livello muscolare. Anche in questo tipo di transgenico si sono avuti gli stessi risultati ottenuti con i topi transgenici-condizionali per Atg7. Infatti si sono osservati aggregati proteici positivi per la proteina p62/SQSTM1, atrofia muscolare e riduzione della forza muscolare. Inoltre l’analisi morfologica, ha rilevato degli accumuli di mitocondri alterati nelle fibre atrofiche, ed un più abbondante numero di fibre con nuclei centrali dopo la delezione del gene Atg7 in maniera acuta rispetto agli animali non-inducibili (Masiero et al., 2009).