Espressione di iNOS e metabolismo dell'adenosina in cellule muscolari lisce vascolari di ratti diabetici

Il diabete è una malattia metabolica associata ad aumentato rischio cardiovascolare. Nel diabete inoltre, in seguito all’attivazione della proteina iNOS, si ha una notevole produzione di perossinitrito che è implicato in molti disordini vascolari. A livello cardiovascolare l’adenosina manifesta diverse proprietà vasoprotettive: induce infatti vasodilatazione, inibisce l’aggregazione piastrinica e ne previene l’adesione, inibisce la crescita delle cellule muscolari lisce vascolari (VSMC) (Ikeda et al., 1997). Diverse evidenze suggeriscono che l’adenosina prodotta dalle VSMC può indurre i suoi effetti in parte attraverso la produzione di NO a livello della parete dei vasi: il nucleoside, per interazione con i recettori A2, modula l’espressione della proteina iNOS indotta da citochine e di conseguenza il rilascio di NO dalle VSMC (Dubey et al., 1998; St. Hilaire et al., 2008). Dal momento che un’aumentata produzione di iNOS è coinvolta nella disfunzione vascolare diabetica, si è studiato il potenziale ruolo anti-infiammatorio dell’adenosina in tale processo, determinando l’effetto del nucleoside e dei composti ad esso correlati sull’espressione di iNOS in cellule muscolari lisce vascolari di ratti resi diabetici in confronto con ratti normoglicemici. A tale scopo ad una parte degli animali è stato indotto il diabete mediante iniezione nella vena caudale di streptozotocina. Il prelievo dell’aorta dei ratti per l’ottenimento delle colture cellulari è stato effettuato dopo quattro settimane dal trattamento, considerando diabetici solo gli animali con valore di glicemia superiore a 300 mg/dl. Per indurre l’espressione della proteina iNOS le cellule muscolari lisce vascolari di ratti sani e diabetici sono state stimolate per 24 h con una miscela costituita da LPS più citochine (citomix) e queste cellule sono state trattate con adenosina esogena. Dall’analisi di Western blot emerge che la purina impiegata in concentrazione 1 mM causa un aumento significativo dei livelli di iNOS nelle cellule di ratti diabetici. Questo aumento non è influenzato dal trattamento con NBTI, inibitore dei trasportatori equilibrativi per l’adenosina, ma è potenziato in seguito all’aggiunta di EHNA, inibitore dell’adenosina deaminasi, enzima che converte l’adenosina in inosina. L’inosina esogena non influenza l’espressione di iNOS nelle VSMC controllo e diabetiche, mentre il precursore dell’adenosina, AMP, mima l’effetto dell’adenosina sulla produzione di iNOS nelle cellule diabetiche. L’AOPCP, inibitore dell’enzima CD73, che promuove la defosforilazione di AMP in adenosina, non provoca variazione dell’espressione di iNOS, rispetto al trattamento con solo AMP. Stimolando le VSMC con citomix e NBTI, EHNA o AOPCP in assenza di purine esogene, si è dimostrato che solo il trattamento con EHNA causa, nelle cellule di ratti normoglicemici, una diminuzione significativa della produzione di iNOS, indicando che l’adenosina deaminasi rappresenta la principale via di eliminazione del nucleoside in condizioni non patologiche. Le quantità di adenosina rimasta nel medium di incubazione dopo 24 h e quella dei suoi metaboliti sono state monitorate con metodo HPLC. Al termine dell’incubazione l’adenosina scompare dal medium, mentre si accumulano inosina e ipoxantina. Nelle cellule controllo NBTI permette il recupero della metà dell’adenosina inizialmente aggiunta, mentre nelle cellule diabetiche il recupero è inferiore, indicando probabilmente un diverso contributo dei trasportatori equilibrativi alla rimozione del nucleoside nel diabete. Al contrario l’aggiunta di EHNA non causa variazioni nella quantità di adenosina recuperata nelle cellule controllo rispetto a quelle diabetiche. Anche l’AMP scompare dal medium dopo 24 h con produzione di inosina e ipoxantina; l’aggiunta di AOPCP permette il recupero del 47% del nucleotide nel medium di incubazione delle cellule di ratti sani e solo il 5% nel medium delle cellule di ratti diabetici, suggerendo un’alterazione dell’attività o dell’espressione dell’enzima CD73 associata al diabete. Questi risultati dimostrano che alterazioni a livello delle vie di eliminazione e formazione dell’adenosina sono presenti nella disfunzione vascolare diabetica. Inoltre, a concentrazioni elevate l’adenosina sembra perdere il suo effetto protettivo, in quanto stimola la formazione di iNOS, con conseguenze che possono essere dannose per la cellula. Il diabete rende, pertanto, le VSMC più sensibili al potenziale effetto proinfiammatorio di elevate concentrazioni di adenosina in termini di espressione della proteina iNOS.