Development of derivatives of natural polyphenols for pharmacological applications

Il progetto di ricerca trattato in questa tesi di dottorato intende contribuire allo sfruttamento farmacologico dei polifenoli vegetali, una vasta famiglia di composti naturali presenti in molti cibi e bevande. Si tratta di un progetto marcatamente interdisciplinare, caratteristica che mi ha permesso di allargare il mio orizzonte culturale e allo stesso tempo di finalizzare il lavoro di sintesi a obiettivi ben definiti. Gli effetti biomedici dei polifenoli vegetali sono oggetto di grande interesse e di molta ricerca, condotta in gran parte in vitro, usando sistemi modello come colture cellulari. Questi studi dimostrano che molti polifenoli possono stimolare o interferire con processi biochimici e che alcuni di essi potrebbero trovare utili applicazioni nella terapia e/o prevenzione di alcune patologie di grande interesse medico, ad esempio per prevenire l’insorgenza e inibire la crescita di molti tipi di cancro, per proteggere il sistema cardiovascolare o ancora per rallentare l’invecchiamento e il decorso di patologie neurodegenerative. Queste potenzialità trovano però un grosso ostacolo nella loro esplicazione a causa della scarsa biodisponibilità di questi composti. Come risultato del loro scarso assorbimento e della cospicua metabolizzazione a livello intestinale ed epatico, infatti, solo piccole quantità di polifenoli entrano nel circolo sanguigno, e per lo più sotto forma di metaboliti. Abbiamo individuato due possibili strategie per aumentare l’efficacia dei polifenoli. Una è di farli concentrare negli organi e/o nei comparti subcellulari in cui le loro proprietà possono avere il massimo impatto. Questo approccio, concretizzato nel targeting mitocondriale, ha portato alla realizzazione di sei lavori, ad oggi già pubblicati (Cap. 1-4), o inviati per la pubblicazione (Cap. 5-6), che costituiscono i primi sei capitoli della tesi. Una seconda strategia per superare il problema della bassa biodisponibilità prevede la realizzazione di nuovi derivati che possano funzionare da veicoli di polifenoli (pro-drugs) resistenti alla metabolizzazione durante l’assorbimento e in grado di rigenerare il composto naturale una volta superata la barriera della metabolizzazione di primo passaggio. I risultati di questi studi sono descritti in due lavori a stampa che costituiscono i capitoli 7-8. Infine, durante uno stage di sei mesi all’Università dell’Illinois, a Chicago, ho effettuato la sintesi di alcuni nuovi derivati della daidzeina, un importante isoflavone della soia, che incorporano la funzionalità per l’inibizione dell’istone deacetilasi, una classe di enzimi coinvolta nell’espressione genica (Capitolo 9). Questi nuovi composti sono tuttora in corso di investigazione biologica al Burke/Cornell Medical Research Institute per verificare un possibile effetto nell’induzione dell’espressione di Arginasi 1. Segue una breve descrizione dei più importanti risultati presentati nella tesi, mentre i principali nuovi composti sintetizzati sono presentati alla fine di questa sezione. Derivati mitocondriotropici. I polifenoli sono molecole redox-attive e possono quindi intervenire nei processi radicalici che sono coinvolti in molte patologie. Il sito principale di produzione dei radicali sono i mitocondri, sede di eventi chiave nella morte cellulare sia per apoptosi che per necrosi, processi in cui hanno un ruolo determinante le specie reattive dell’ossigeno. Importante per la genesi di questa ricerca è stata l’osservazione che la quercetina (3,3’,4’,5,7-pentaidrossiflavone) è in grado di inibire o indurre l’apertura del poro di transizione di permeabilità mitocondriale, a seconda che prevalga la sua attività anti- o pro-ossidante. Questo dipende da diversi fattori, tra cui l’azione di ioni metallici e di enzimi redox, il pH e la concentrazione del polifenolo stesso. Ho sintetizzato alcuni nuovi derivati mitocondriotropici di quercetina e resveratrolo (3,4’,5-triidrossi-t-stilbene), due polifenoli naturali molto diffusi e molto studiati in quanto dotati di interessanti proprietà. Questi composti sono resi mitocondriotropici grazie alla funzionalizzazione con un gruppo trifenilfosfonio (TPP+), un catione in grado di diffondere attraverso le membrane biologiche e di accumularsi in regioni a potenziale negativo, quali la matrice mitocondriale. La quercetina possiede 5 ossidrili di cui nessuno è equivalente ad un altro. Per queste sintesi è stato quindi rilevante sviluppare approcci regioselettivi ma allo stesso tempo relativamente semplici e ad alta resa. La strategia generale per la sintesi dei derivati della quercetina ha pertanto richiesto passaggi di protezione/deprotezione selettiva delle funzionalità ossidriliche (Capitoli 1 e 3). I composti sintetizzati si sono comportati come previsto in saggi in vitro, nei quali è stato possibile verificare un effettivo accumulo in organelli subcellulari a morfologia mitocondriale (Capitoli 1 e 2). Le possibili applicazioni in campo biomedico dei derivati “mitocondriotropici” possono essere interessanti sia nel caso prevalga una loro azione anti-ossidante/citoprotettiva che pro-ossidante/citotossica. Una prima indagine su quale sia l’effetto biologico di questi nuovi composti è stata condotta con mitocondri isolati, utilizzando due derivati della quercetina modificati in posizione 3, ovvero il 3-O-(4-trifenilfosfoniobutil) quercetina ioduro (3-QBTPI), e il suo analogo peracetilato (3-QTABTPI). In accordo con osservazioni fatte in precedenza con la quercetina, questi composti si sono rivelati potenziali co-induttori della transizione di permeabilità mitocondriale e inibitori dell’ATP sintasi mitocondriale (Capitolo 4). Per verificare la rilevanza della posizione occupata dal sostituente sullo scheletro della quercetina ho inoltre sintetizzato l’isomero mitocondriotropico di 3-QBTPI recante la funzionalizzazione con il fosfonio in posizione 7 (Capitolo 3). E’ stata quindi eseguita una caratterizzazione del comportamento redox dei due isomeri mitocondriotropici 3- e 7-(4-O-trifenilfosfoniobutil) quercetina ioduro. Sia nella determinazione del potenziale anodico di ossidazione che nel saggio di attività antiossidante utilizzando l’1,1-difenil-2-picrilidrazil (DPPH), l’isomero 7-sostituito si è comportato in maniera simile alla quercetina, mentre l’isomero 3-sostituito è risultato meno reattivo. Il derivato 7-sostituito ha inoltre manifestato una maggiore attività citotossica nei saggi di vitalità cellulare effettuati: è stato quindi selezionato come candidato ideale per ulteriori studi (Capitolo 5). I derivati mitocondriotropici della quercetina inducono processi di morte cellulare non programmata (necrosi) e agiscono da proossidanti, generando anione superossido nei mitocondri. La morte cellulare è causata dalla generazione di superossido. L’induzione della necrosi è selettiva e colpisce cellule di tipo tumorale (C-26) e fibroblasti embrionali murini a crescita rapida (MEF) ma non fibroblasti embrionali murini a crescita lenta. Quantificazioni del contenuto mitocondriale e della produzione di superossido suggeriscono che la selettività dell’effetto citotossico potrebbe essere messa in relazione con la concentrazione di superossido mitocondriale (Capitolo 6). Prodrugs di polifenoli. L’interesse per questi derivati nasce dall’idea di utilizzare reazioni comuni nella sintesi organica per sintetizzare derivati del resveratrolo, il polifenolo modello utilizzato per questo studio, recanti gruppi protettori sulle funzionalità ossidriliche. Lo scopo di questa protezione è di rallentare o eliminare i processi metabolici in fase di assorbimento, ottenendo quindi livelli sistemici del polifenolo più elevati in seguito alla rimozione dei gruppi protettori per idrolisi catalizzata da enzimi ubiquitari. La strategia adottata inizialmente è basata sulla protezione degli ossidrili mediante legami di tipo carbossiestereo e ha prodotto diversi derivati del resveratrolo (Capitolo 7). Studi di stabilità in sangue, in vivo (farmacocinetiche nel ratto) ed ex vivo (camerette di Ussing) hanno però dimostrato che questo gruppo protettore è inadatto ai nostri scopi, in quanto troppo velocemente idrolizzato da attività esterasiche aspecifiche del sangue e della superficie intestinale. Sono stati quindi selezionati altri tipi di legame da utilizzare per la protezione reversibile degli ossidrili e per realizzare derivati meno suscettibili all’idrolisi di quanto non siano i derivati carbossiesterei. Il primo tipo di legame saggiato è stato l’estere metansolfonico (mesilato) (–O(SO2)CH3) (Capitolo 7). Questo derivato si è dimostrato stabile in saggi in vitro a differenza dei derivati carbossiesterei che si idrolizzano lentamente in soluzioni a pH simili a quelli di stomaco e intestino e si convertono rapidamente a resveratrolo in sangue murino. In esperimenti di permeazione ex vivo utilizzando segmenti di intestino di ratto espiantati e montati in camerette di Ussing i derivati carbossiesterei si ritrovano nel comparto basolaterale essenzialmente come una miscela di metaboliti. Il precursore trimesilato si ritrova invece nel comparto basolaterale senza che sia possibile evidenziare prodotti di idrolisi o modificazioni metaboliche dovute al passaggio della parete intestinale. Esperimenti preliminari di farmacocinetica hanno suggerito che questo tipo di legame è troppo stabile e non suscettibile di idrolisi enzimatica anche in vivo, impedendo quindi la rigenerazione della forma attiva del polifenolo. Risultati analoghi sono stati ottenuti con il secondo tipo di derivati sintetizzato in cui gli ossidrili del resveratrolo sono stati protetti da funzionalità alchil eteree. I polifenoli sono scarsamente solubili in acqua, e la solubilità è un fattore determinante per la biodisponibilità di un composto e per una comoda somministrazione. Abbiamo quindi sintetizzato un primo derivato del resveratrolo (RGS) legando gli ossidrili del polifenolo al glucosio mediante un ponte succinico (Capitolo 8). Studi di farmacocinetica con questo composto dimostrano che l’assorbimento è ritardato rispetto al resveratrolo, un risultato potenzialmente utile. I livelli e la natura dei metaboliti in circolo sono però del tutto analoghi a quelli ottenuti somministrando resveratrolo; questo risultato suggerisce che il derivato subisca idrolisi a resveratrolo nel tratto intestinale, prima dell’assorbimento, compatibilmente con la nota instabilità del legame carbossiestereo in vivo. Derivati della daidzeina. Durante un periodo di sei mesi (marzo/agosto 2010) presso il gruppo di ricerca del Prof. Alan Kozikowski alla UIC (University of Illinois at Chicago) ho effettuato la sintesi di alcuni nuovi derivati della daidzeina, un importante polifenolo naturale appartenente alla famiglia degli isoflavoni della soia. La daidzeina induce l’espressione dell’arginasi 1 (Arg 1), un enzima coinvolto nella biosintesi delle poliammine, che hanno un ruolo protettivo e favoriscono la rigenerazione di neuriti nel sistema nervoso centrale traumatizzato. Essa inoltre è un ben noto agonista del recettore estrogenico β e può agire anche da inibitore delle istone deacetilasi (HDACs), enzimi coinvolti nella regolazione dell’espressione genica. Abbiamo quindi cercato di combinare in una sola molecola queste varie proprietà, producendo dei derivati che inducessero l’espressione di Arg1 rimanendo comunque capaci di interagire con il recettore degli estrogeni, e con una maggiore affinità per le HDACs. Per potenziare l’attività inibitoria nei confronti di questi ultimi enzimi ho unito la funzionalità dell’acido idrossammico allo scheletro molecolare della daidzeina, usando strumenti chimici come l’addizione di Michael sulla daidzeina protetta e la “click chemistry”. La ritenzione della struttura dell’isoflavone e le funzionalità ossidriliche libere dovrebbero assicurare la ritenzione dell’attività estrogenica. In cinque passaggi sintetici sono giunto a quattro prodotti stereoisomerici, la cui farmacologia è ancora sotto studio.