Computational methods for the analysis of gene expression from RNA sequencing data

Il patrimonio genetico di ogni organismo vivente è codificato, sotto forma di DNA, nel genoma. Il genoma è costituito da geni e da sequenze non codificanti e racchiude in sé tutte le informazioni necessarie al corretto funzionamento delle cellule dell'organismo. Le cellule possono accedere a specifiche istruzioni di questo codice tramite un processo chiamato espressione genica, ovvero attivando o disattivando un particolare set di geni e trascrivendo l'informazione necessaria in RNA. L'insieme degli RNA trascritti caratterizza quindi un preciso stato cellulare e può fornire importanti informazioni sui meccanismi coinvolti nella patogenesi di una malattia. Recentemente, una metodologia per il sequenziamento dell'RNA, chiamata RNA-seq, sta rapidamente sostituendo i microarray nello studio dell'espressione genica. Grazie alle proprietà delle tecnologie di sequenziamento su cui è basato, l'RNA-seq permette di misurare il numero di RNA presenti in un campione e al contempo di "leggerne" l'esatta sequenza. In realtà, il sequenziamento produce milioni di sequenze, chiamate "read", che rappresentano piccole stringhe lette da posizioni random degli RNA in input. Le read devono quindi essere mappate con un algoritmo su un genoma di riferimento, in modo da ricostruire una mappa trascrizionale, in cui il numero di read allineate su ciascun gene dà una misura digitale (chiamata "count") del suo livello di espressione. Sebbene a prima vista questa procedura possa sembrare molto semplice, lo schema di analisi integrale è in realtà molto complesso e non ben definito. In questi anni sono stati sviluppati diversi metodi per ciascuna delle fasi di elaborazione, ma non è stata tuttora definita una pipeline di analisi dei dati RNA-seq standardizzata. L'obiettivo principale del mio progetto di dottorato è stato lo sviluppo di una pipeline computazionale per l'analisi di dati RNA-seq, dal pre-processing alla misura dell'espressione genica differenziale. I diversi moduli di elaborazione sono stati definiti e implementati tramite una serie di passi successivi. Inizialmente, abbiamo considerato e ridefinito metodi e modelli per la descrizione e l'elaborazione dei dati, in modo da stabilire uno schema di analisi preliminare. In seguito, abbiamo considerato più attentamente uno degli aspetti più problematici dell'analisi dei dati RNA-seq: la correzione dei bias presenti nei count. Abbiamo dimostrato che alcuni di questi bias possono essere corretti in modo efficace tramite le tecniche di normalizzazione correnti, mentre altri, ad esempio il "length bias", non possono essere completamente rimossi senza introdurre ulteriori errori sistematici. Abbiamo quindi definito e testato un nuovo approccio per il calcolo dei count che minimizza i bias ancora prima di procedere con un'eventuale normalizzazione. Infine, abbiamo implementato la pipeline di analisi completa considerando gli algoritmi più robusti e accurati, selezionati nelle fasi precedenti, e ottimizzato alcun step in modo da garantire stime dell'espressione genica accurate anche in presenza di geni ad alta similarità. La pipeline implementata è stata in seguito applicata ad un caso di studio reale, per identificare i geni coinvolti nella patogenesi dell'atrofia muscolare spinale (SMA). La SMA è una malattia neuromuscolare degenerativa che costituisce una delle principali cause genetiche di morte infantile e per la quale non sono ad oggi disponibili né una cura né un trattamento efficace. Con la nostra analisi abbiamo identificato un insieme di geni legati ad altre malattie del tessuto connettivo e muscoloscheletrico i cui pattern di espressione differenziale correlano con il fenotipo, e che quindi potrebbero rappresentare dei meccanismi protettivi in grado di combattere i sintomi della SMA. Alcuni di questi target putativi sono in via di validazione poiché potrebbero portare allo sviluppo di strumenti efficaci per lo screening diagnostico e il trattamento di questa malattia. Gli obiettivi futuri riguardano l'ottimizzazione della pipeline definita in questa tesi e la sua estensione all'analisi di dati dinamici da "time-series RNA-seq". A questo scopo, abbiamo definito il design di due data set "time-series", uno reale e uno simulato. La progettazione del design sperimentale e del sequenziamento del data set reale, nonché la modellazione dei dati simulati, sono stati parte integrante dell'attività di ricerca svolta durante il dottorato. L'evoluzione rapida e costante che ha caratterizzato i metodi per l'analisi di dati RNA-seq ha impedito fino ad ora la definizione di uno schema di analisi standardizzato e la risoluzione di problematiche legate a diversi aspetti dell'elaborazione, quali ad esempio la normalizzazione. In questo contesto, la pipeline definita in questa tesi e, più in ampiamente, i temi discussi in ciascun capitolo, toccano tutti i diversi aspetti dell'analisi dei dati RNA-seq e forniscono delle linee guida utili a definire un approccio computazionale efficace e robusto.