Generation of novel zebrafish models of sarcoglycanopathy

Le sarcoglicanopatie sono quattro rare patologie autosomiche recessive appartenenti alla famiglia delle distrofie muscolari di tipo 2 (LGMD2C-F). Esse sono causate da mutazioni nei geni SGCG, SGCA, SGCB, SGCD codificanti rispettivamente per γ-, α-, β- e δ- sarcoglicano (SG). I SG formano un complesso tetramerico nel sarcolemma, connesso a quello delle glicoproteine associate alla distrofina (DAPC), essenziale per garantire l'integrità della membrana durante la contrazione muscolare (Bushby, 2009). Mutazioni dei SG causano la perdita/riduzione della proteina mutata e dei partner wild type (WT), alterando le proprietà strutturali del DAPC e aumentando la fragilità del sarcolemma. La maggior parte delle mutazioni sono di tipo missenso e, causando un problema nel folding, portano alla prematura degradazione della proteina mutata effettuata dalla via ERAD (degradazione associata al reticolo endoplasmatico) attraverso il proteasoma (Gastaldello et al., 2008; Bartoli et al., 2008). La conoscenza del meccanismo patologico ha aperto nuove strade a due possibili interventi farmacologici: inibendo la degradazione o assistendo il processo di folding dei mutanti, il complesso dei SG è recuperato riducendo così la fragilità della membrana (Bianchini et al., 2014; Carotti et al., 2018). Questi dati prodotti in vitro suggeriscono che molti mutanti sono ancora funzionali, sebbene strutturalmente difettosi. Tuttavia, per la messa a punto di un approccio terapeutico, questi dati necessitano di una validazione in vivo, attraverso modelli animali per mimare la malattia umana e recanti quindi mutazioni missenso nei SG. In assenza di modelli murini, un’alternativa promettente per lo studio di molte malattie, fra cui i disturbi muscolari, è rappresentata dallo zebrafish (D.rerio). Tra gli ortologhi dei SG umani, β- e δ-SG sono i più conservati e quindi sono stati scelti per produrre linee knock-out (KO) e knock-in (KI). La bontà dell’uso di questo vertebrato nel mimare la sarcoglicanopatia nasce da uno studio preliminare di Knock-Down con morfolino contro il δ-SG. I morfanti ottenuti hanno mostrato: alterazioni morfologiche, danni alla struttura muscolare e compromissione delle capacità motorie. Grazie a queste premesse, il sistema CRISPR/Cas9 è stato usato per generare modelli KO di β- e δ-SG. In entrambi i casi, l'assenza della proteina provoca la progressiva alterazione della struttura muscolare e delle capacità motorie. Attualmente stiamo usando i KO come background per l'iniezione della sequenza WT o mutata dei SG, sia di origine umana sia di zebrafish. La prima dovrebbe consentire il recupero del fenotipo, mentre quella delle forme mutate permetterà di valutare la capacità dello zebrafish di riconoscerle e degradarle. Questi esperimenti sono della massima importanza per verificare l'idoneità dello zebrafish nel mimare le forme di sarcoglicanopatia causate da mutazioni missenso. La generazione di due modelli KI in zebrafish, β-SGT145R/T145R e δ-SGE264K/E264K, prevede l’attivazione della via di riparazione HDR (riparazione omologa diretta). Poiché l'efficienza della ricombinazione omologa è molto bassa, è necessario l’uso di un metodo altamente selettivo per identificare i pesci positivi alla voluta mutazione. Lo screening delle mutazioni somatiche per l'introduzione della mutazione T145R nel gene z-sgcb è stato positivo. Attualmente stiamo aspettando la maturazione sessuale della popolazione F0 per identificare quei pesci in cui ricombinazione sia avvenuta nella linea germinale. Se le linee KI, una volta caratterizzate, mimeranno la patologia umana, rappresenteranno uno strumento fondamentale per testare l'approccio farmacologico proposto in vitro, e costituiranno un valido stimolo per la ricerca di base e traslazionale.