STRUCTURAL AND FUNCTIONAL STUDIES OF HELICOBACTER PYLORI PROTEINS CONTRIBUTING TO STOMACH COLONIZATION AND PATHOGENICITY

Helicobacter pylori è un batterio microaerofilo Gram-negativo in grado di instaurare un’infezione cronica nello stomaco umano in più della metà della popolazione mondiale. L’infezione è generalmente asintomatica ma, in alcuni casi, H. pylori causa patologie gastroduodenali, quali ulcere gastriche e duodenali, adenocarcinomi e linfomi gastrici. H. pylori è caratterizzato da elevata variabilità genetica, non solo all’interno delle sequenze geniche ma anche nel contenuto genico. Una delle differenze più importanti nei ceppi di H. pylori è la presenza o l’assenza di una sequenza di DNA di 40 kb chiamata Isola di Patogenicità cag, che codifica per un Sistema di Secrezione di tipo IV, che provoca la traslocazione della tossina CagA nelle cellule epiteliali gastriche. Dopo l’entrata nella cellula ospite, CagA induce modifiche cellulari come l’alterazione della struttura cellulare e della motilità, l’alterazione della proliferazione cellulare e delle tight junctions. La maggior parte dei ceppi di H. pylori secernono VacA, una tossina che provoca vacuolizzazione delle cellule epiteliali dello stomaco. Tutti i ceppi di H. pylori contengono il gene vacA, ma la sequenza genica è caratterizzata da un’elevata variabilità, causando modifiche nella funzionalità della tossina. Altre caratteristiche condizionate dalla variabilità genetica sono l’espressione e la forza di legame delle adesine. Tutte queste caratteristiche sono coinvolte nella diversità del grado di virulenza di H. pylori, assieme a HP-NAP, una tossina in grado di attivare la risposta immunitaria (Capitolo I). Sebbene la terapia antibiotica sia in grado di eradicare H. pylori nella maggior parte dei pazienti, la resistenza ai chemioterapici da parte dei batteri rimane un problema sempre crescente. Per questo motivo, sono necessarie nuove terapie per l’eradicazione del batterio e, in questo contesto, è importante identificare nuovi bersagli farmaceutici per lo sviluppo di nuovi antibiotici specifici. Recentemente uno studio di mutagenesi sistematica del genoma di H. pylori ha permesso d’identificare nuovi geni coinvolti nella colonizzazione dello stomaco. Dei geni analizzati, 29% hanno evidenziato un effetto nella colonizzazione gastrica. Tra questi sono stati identificati geni di virulenza già noti, geni importanti per la virulenza in altri patogeni e geni codificanti per proteine ignote. Scopo di questo progetto di dottorato è determinare la struttura tridimensionale di proteine di H. pylori importanti per la colonizzazione dello stomaco e la patogenesi e ottenere informazioni sulla loro putativa funzione. In particolare, sono state studiate le proteine HP1287, omologo di TenA, la putativa adesina HP1028, HP0175, una tossina con attività PPIasica e HP0421, una colesterol-α-glucosiltrasferasi che inibisce la risposta immunitaria. La maggior parte del progetto è stata effettuata presso il laboratorio di Biologia Strutturale del Prof. Zanotti al Dipartimento di Chimica Biologica dell’Università di Padova e presso l’Istituto Veneto di Medicina Molecolare (VIMM) di Padova. La strategia di lavoro adottata comprendeva analisi bioinformatiche, amplificazione dei geni selezionati mediante PCR a partire dal DNA genomico di H. pylori (ceppo CCUG 17874), clonaggio in un vettore di espressione in fusione con un His-tag N-terminale e l’espressione della proteina in cellule batteriche di Escherichia coli. Le proteine ricombinanti solubili sono state poi purificate usando due passaggi cromatografici e concentrate per le prove di cristallizzazione. Le proteine HP1028 e HP1287 sono state successivamente cristallizzate e, nel caso di HP1287, è stata risolta la struttura mediante diffrattometria ai raggi X. Inoltre, sono state utilizzate anche tecniche per verificare la qualità del campione per la cristallizzazione, come il DLS (Dynamic Light Scattering) e per analizzare la struttura secondaria, come il Dicroismo circolare (CD). Tecniche di mutagenesi sono state impiegate per studi funzionali e per fini cristallografici. Dopo un’introduzione generale, nel capitolo II è descritta l’analisi strutturale e funzionale di HP1287 di H. pylori. HP1287 è un omologo di TenA di B. subtilis, un enzima coinvolto nel recupero di precursori della tiamina. La proteina è stata clonata, espressa, purificata e cristallizzata. La struttura è stata risolta mediante Sostituzione Molecolare ad una risoluzione di 2.7 Å. La struttura evidenzia un elevato grado di similarità con TenA di B. subtilus, con la sola differenza della sostituzione di un amminoacido nel sito attivo (una tirosina sostituita con una fenilalanina in HP1287). Poiché HP1287 sembrava non essere attiva nello stesso substrato di TenA di B. subtilis, per verificare l’importanza della tirosina in posizione 47 nel ripristino dell’attività catalitica, è stato creato un mutante F47Y, che però non ha evidenziato una maggior capacità di catalisi rispetto alla HP1287 nativa. Inoltre, la collocazione dell’istidina 86 nel sito attivo di HP1287, sembrerebbe suggerire un’interazione dell’amminoacido con il substrato non possibile nel caso di TenA di B. subtilis. Tutte queste informazioni suggeriscono come questa proteina potrebbe metabolizzare un composto leggermente diverso da quello di TenA di B. subtilis, che deriva dalla degradazione della tiamina nello stomaco. Il terzo capitolo descrive il clonaggio, l’espressione, la purificazione e la cristallizzazione di HP1028, una putativa adesina importante per la colonizzazione dello stomaco. Per identificare un detergente in grado d’inibire l’aggregazione, campioni proteici sono stati incubati con numerosi detergenti e analizzati mediante DLS (Dynamic Light Scattering). Non essendo nota alcuna struttura di alcuna proteina omologa, per ottenere fasi approssimate iniziali per la risoluzione della struttura, la proteina HP1028 è stata espressa sostituendo le metionine con selenometionine e purificata. Per amplificare il segnale anomalo del selenio, è stato creato un doppio mutante contenente due ulteriori metionine nella sequenza amminoacidica. Dati preliminari della proteina HP1028 nativa e mutante sono stati raccolti ad una risoluzione massima di 2.4 Å. HP0175 è una Peptidil-Prolil-cis,trans-Isomerasi che induce l’apoptosi di cellule gastriche attraverso il TLR4 (descritta nel capitolo IV). Dopo il clonaggio del gene nel plasmide d’espressione, la proteina è stata espressa e purificata in elevata quantità e la struttura secondaria è stata analizzata mediante CD. Per ridurre l’eccessivamente alta solubilità della proteina, è stata adottata una metodica di metilazione delle lisine e sono state effettuate numerose prove di cristallizzazione della proteina derivatizzata. Infine, nell’ultimo capitolo (Capitolo V) è descritta la proteina HP0421, una colesterol-α- glucosiltransferasi che promuove l’immuno-evasione. Cellule batteriche di H. pylori contenenti alti livelli di colesterolo sono facilmente fagocitate dai macrofagi. La glicosilazione del colesterolo inibisce l’uptake di H. pylori da parte dei macrofagi e l’attivazione dei linfociti T. Questa parte del progetto di dottorato è stata svolta presso l’istituto Max Planck di Berlino, sotto la supervisione del Prof. Thomas F. Meyer. La proteina ricombinante, espressa in E. coli, sembrava non essere in grado di legare la resina d’affinità IMAC-Ni2+, probabilmente a causa della degradazione dell’His-tag C-terminale. Per risolvere questi problemi durante la fase di purificazione, sono stati adottati due approcci: il clonaggio d’un nuovo costrutto di HP0421 con un His-tag N-terminale e la purificazione e il refolding della proteina HP0421 dal pellet batterico, validato da test di attività. Inoltre, studi di DLS su HP0421, purificata in modeste quantità, hanno evidenziato lo stato di aggregazione della proteina. Per inibire l’interazione aspecifica tra le molecole proteiche, sono state effettuate prove di disaggregazione con detergenti, verificate mediante analisi DLS.