H2O2 release by isoloated mitochondria and a new approach for the evaluation of H2O2 sources in intact cells

L’ H2O2 è un metabolita accertato nelle cellule viventi. A lungo considerata una forma attivata dell’ossigeno particolarmente dannosa, recentemente è stata rivalutata come mediatore fondamentale della funzionalità cellulare per i suoi molteplici ruoli in situazioni sia fisiologiche che patologiche. Oltre a riconoscerne un ruolo importante nei meccanismi di difesa contro patogeni viene ampiamente suggerita come molecola messaggero in una serie di comunicazioni intra e intercellulari grazie alla sua caratteristiche di stabilità e diffusibilità uniche fra i derivati reattivi dell’ossigeno (ROS). Può essere prodotta direttamente da alcune ossidasi o in seguito a dismutazione del superossido prodotto principalmente dalle NADPH ossidasi di membrana e dalla catena respiratoria mitocondriale. Nella catena respiratoria mitocondriale il superossido (O2•-), dismutato ad H2O2 dalla superossido dismutasi Mn-dipendente, viene prodotto soprattutto a livello del complesso I e risente del potenziale e dello stato redox di vari componenti la catena respiratoria. Tale produzione è bassa in presenza di substrati NAD dipendenti (nel nostro caso glutammato più malato), e alta, e rotenone sensibile, in presenza di succinato. Nella prima parte della tesi si evidenzia come la produzione di O2.- in mitocondri isolati possa avvenire a concentrazioni submillimolari di succinato, anche in presenza di substrati NAD dipendenti, condizioni ritenute simili a quelle fisiologiche. Inoltre la presenza di acil-CoA a lunga catena inibisce la produzione di H2O2 dipendente da succinato, in un modo indipendente dalla loro ossidazione. I mitocondri appaiono quindi una delle più probabili fonti di produzione fisiologica modulabile di H2O2 intra-cellulare. La critica più pesante a studi fatti su preparazioni subcellulari è la loro effettiva congruità al modello cellulare o tissutale. Obiettivo del lavoro era quindi estendere i dati ottenuti in mitocondri isolati a un modello più complesso: la cellula intera. Il grosso limite allo studio è determinato dalla particolare esiguità della produzione di H2O2 in condizioni fisiologiche e dalla scarsa affidabilità dei metodi di misura intracellulari. Infatti, le principali sonde fluorescenti, come la diidrorodamina (DHR) o la diclorofluoresceina (DCFH) utilizzate per la detection dell’H2O2 in cellula intera non sono affidabili, come ampiamente discusso in letteratura. Il basso segnale e la mancanza di specificità di queste sonde, a nostro avviso, è dovuta soprattutto alla carenza di uno catalizzatore per la reazione sonda/H2O2. Abbiamo pensato quindi di esprimere all’interno delle cellule l’enzima Horseradish Peroxidase (HRP), ampiamente utilizzato per la misura dell’ H2O2 in esperimenti in vitro accoppiato a sonde spettroscopiche. L’espressione dell’HRP all’interno delle cellule aumenta visibilmente la sensibilità delle sonde e la specificità della reazione con l’H2O2. Infatti è stato possibile misurare, per la prima volta in cellula intera, la produzione di H2O2 derivata dall’attività Mono-Ammino Ossidasica (MAO) come incremento di velocità della ossidazione della DHR o DCFH2 indotta da Tiramina, substrato della MAO. L’integrità cellulare e la risposta metabolica non vengono modificate significativamente dalla trasfezione con HRP. Inoltre la specificità della misura (verificata con l’aggiunta esogena di H2O2 e per competizione con i sistemi di rimozione endogeni) conferma che le cellule trasfettate con HRP sono un buon modello per lo studio del coinvolgimento dell’H2O2 nella fisiologia cellulare. Nell’ultima parte della ricerca vengono presentati risultati preliminari che indicano come il metodo sia sufficientemente sensibile alla misura della quota di H2O2 di origine mitocondriale. Infatti si evidenzia una maggiore velocità di ossidazione della DHR in presenza di rotenone, simile all’incremento ottenuto nei mitocondri isolati in presenza di Glutammato/Malato. Inoltre si evidenzia un aumento dell’ossidazione della DHR in presenza del dietil-succinato, una forma permeabile di succinato. L’aumentata ossidazione viene inibita da difenilene iodonio, che si dimostra essere anche un potente inibitore dell’ossidazione e quindi della produzione di H2O2 sia dei substrati NAD dipendenti che del succinato in mitocondri isolati. Inoltre, come già ipotizzato in letteratura, mostriamo che la produzione di H2O2 dipendente dalla MAO è largamente superiore a quella mitocondriale indotta da alte concentrazioni di dietil-succinato in cellula. Complessivamente il modello di cellule trasfettate con HRP sembra essere sufficientemente sensibile per misurare il contributo alla produzione di H2O2 di varie fonti intracellulari e quindi tale da poter essere utilizzato in varie condizioni fisiologiche o patologiche.