INTERFERENZA TRA I SEGNALI CELLULARI DELL'INSULINA E DELL'IFN: POSSIBILE LINK TRA INSULINO RESISTENZA (IR) E RIDOTTA RISPOSTA ALLA TERAPIA ANTIVIRALE NELL'INFEZIONE CRONICA DA VIRUS DELL'EPATITE C (HCV)

L'infezione cronica da virus dell'epatite C (CHC) colpisce 170-200 milioni di persone nel modo. Essa rappresenta una delle principali cause di malattia acuta e cronica del fegato che porta allo sviluppo di cirrosi ed epatocarcinoma (HCC) nei paesi occidentali. Attualmente il trattamento terapeutico dell'HCV è basato sull'utilizzo di interferone-alpha peghilato (PEG-IFN-a) somministrato in combinazione con l'analogo guanosidico ribavirina. Tuttavia, la risposta virologica sostenuta (SVR) si ottiene solo nel 50-80% dei pazienti in base al genotipo virale (1). Il fallimento della terapia antivirale sembra essere legato sia alle caratteristiche dell'ospite che a fattori virali che includono il genotipo virale, la carica virale, l'età, il sesso maschile, l'indice di massa corporea (BMI), il grado di fibrosi e la razza africana. Studi recenti hanno evidenziato che l'insulino-resistenza (IR) è una condizione frequente nei pazienti con CHC se paragonati a pazienti con altre forme di malattia epatica (2), inoltre la prevalenza dell'IR è maggiore nei pazienti infettati con HCV di genotipo 1 (3). Tuttavia i meccanismi che portano all'IR nei pazienti HCV sono di difficile comprensione a causa della coesistenza di numerosi cofattori coinvolti nella sindrome metabolica. Shintany et al (4) ha suggerito che l'HCV sembra essere direttamente coinvolto nella patogenesi dell'IR mediante una modulazione del segnale intracellulare dell'insulina da parte delle proteine virali (5). IR ha una certa rilevanza clinica poiché è associata al diabete di tipo 2 (3, 6) e correla con la progressione della fibrosi epatica, cirrosi e HCC (7, 8). Inoltre, parecchie evidenze cliniche dimostrano che l'IR può essere considerato un fattore predittivo negativo della risposta alla terapia antivirale in pazienti CHC trattati con PEG-IFN-a e ribavirina (9, 10). In un recente studio clinico abbiamo dimostrato che in pazienti HCV l'inefficacia della risposta alla terapia antivirale può essere dimostrata già dopo 24 ore dalla prima iniezione di PEG-IFN, esiste, infatti, una relazione lineare tra il calo viremico e i livelli di insulina al basale più che con l'indice HOMA-IR. Questi risultati suggeriscono fortemente l'ipotesi che l'insulina, probabilmente favorendo l'over-espressione di fattori intracellulari, possa interferire con il pathway dell'IFN, bloccando l'effetto soppressivo dell'IFN sulla replica virale negli epatociti infettati (12). I meccanismi mediante cui l'insulina interferisce con il segnale dell'IFN-a non sono ancora stati chiariti e sono ancora molto studiati. Questi fattori potrebbero comprendere i membri della famiglia SOCS (Suppressor of Cytokine Signaling), un gruppo di proteine la cui espressione è indotta anche dal trattamento con l'insulina (17). Essi agiscono come regolatori negativi di numerosi pathway intracellulari, tra cui lo stesso segnale dell'insulina, poiché alterano l'attività tirosin chinasica di numerosi recettori di fattori di crescita (13-17). E' stato dimostrato che la soppressione specifica di SOCS3, mediante oligonucleotidi antisenso in topi obesi, porta ad una riduzione dei livelli di insulina in circolo migliorando la sensibilità all'insulina (18, 19). Le proteine SOCS1 e SOCS3 modulano il segnale dell'insulina tramite differenti meccanismi: inibizione dell'attività chinasica del recettore dell'insulina, attraverso la degradazione mediata dall'ubiquitina, e riduzione della fosforilazione a livello della tirosina di IRS-1 e 2 (Insulin Receptor Substrate-1 and 2) (20). Inoltre è stato dimostrato, in vitro, che l'over-espressione di SOCS3 è associata ad una riduzione dell'attività antivirale e anti-proliferativa dell'IFN-a (21, 22) e che in biopsie epatiche di pazienti HCV è strettamente associata alla ridotta risposta alla terapia antivirale (23-28). In risposta all'infezione virale L'IFN-a è prodotto dalle cellule epiteliali, dalle cellule dendritiche e dai linfociti. Il legame dell'IFN-a al recettore di classe I induce una rapida fosforilazione e attivazione di alcuni importanti effettori del segnale intracellulare dell'IFN, come le proteine JAK e STAT, questo porta alla trascrizione dei geni stimolati dall'IFN (ISGs) che hanno importanti proprietà antivirali. Gli ISGs comprendono myxovirus resistance 1 (MxA), 2’-5’ oligoadenylatesynthetase 1 (OAS-1) e double-stranded RNA (dsRNA)-dependent protein kinase (PKR) (29). Sulla base di queste evidenze cliniche e sperimentali lo scopo di questo progetto di ricerca è stato quello di analizzare in vitro come l'espressione degli IFN-Stimulated-Genes (ISGs), effettori del segnale dell'IFN con proprietà antivirali, possa essere modulata in seguito a trattamento con insulina. Si è voluto inoltre verificare il possibile meccanismo mediante il quale l'insulina è in grado di interagire sulla risposta cellulare all'IFN- a andando a valutare il ruolo l'espressione di un membro della famiglia di Suppressor of Cytokine Signalling (SOCS), SOCS3. E' noto, infatti, che l'espressione di SOCS3 aumenta notevolmente dopo trattamento con insulina. A tal scopo la tecnologia utilizzata è stata quella degli siRNA. La linea cellulare di epatocarcinoma HepG2 è stata trattata con IFN-a (100 IU/ml) e insulina (100nM and 1000nM) da soli o in co-stimolazione per diversi tempi di incubazione (2, 4, 8 e 12 ore). Dopo l'estrazione dell'RNA totale è stata eseguita l'analisi di espressione genica degli ISGs (PKR, MxA e OAS-1) mediante Real Time PCR. Sugli stessi campioni è stata fatta anche l'analisi dell'espressione proteica di PKR mediante Western-blot. Utilizzando lo stesso modello sperimentale sono stati condotti degli esperimenti di siRNA sui quali è stato valutato l'effetto del silenziamento di SOCS3 sull'espressione genica degli ISGs. Come da atteso il trattamento con solo IFN-a induce un aumento dei livelli di RNA di tutti i geni ISGs analizzati. Lo stimolo con sola insulina non ha alcun effetto sull'espressione genica degli ISGs; questo dimostra che la loro over-espressione è stimolo-specifica ed avvalora la specificità dell'analisi condotta. Tuttavia, il pre-trattamento della linea cellulare HepG2 con diverse concentrazioni di insulina (100 e 1000 nM) e poi lo stimolo con IFN-a (100 UI/mL) ha dimostrato chiaramente che l'insulina è in grado di diminuire l'espressione genica degli ISGs in modo dose-dipendente. Tale risultato è particolarmente evidente se espresso come AUC (area under the curve), che considera la produzione totale di trascritto durante tutto il tempo di stimolazione. AUC media: trattamento con solo IFN-a: PKR = 38,97 + 8,60; MxA= 12531,89 + 4667,98; OAS-1= 24,63 + 5,58); IFN+ insulina100nM: PKR = 19,94 + 8,03 (P=0,017); MxA= 3679,34 + 1158,01 (P=0,0103); OAS-1= 7,1 + 3,76 (P=0,002); IFN+ insulina1000nM: PKR = 11,46 + 0,01 (P=0,0017).; MxA= 949,04 + 100,07 (P=0,0186); OAS-1= 1,37 + 1,36(P=0,006). I risultati ottenuti dall’analisi quantitativa dell’mRNA di PKR hanno trovato un solido riscontro nella successiva valutazione dell’espressione di PKR proteina. Si osserva, infatti, una significativa riduzione della proteina, rispetto al trattamento con solo IFN-a, quando le cellule HepG2 vengono incubate sia con insulina (100 nM) che con IFN-a (100UI/ml). Allo scopo di verificare il ruolo di SOCS3, indotto dall'insulina, come possibile soppressore citoplasmatico dello stimolo interferonico le cellule HepG2 sono state trasfettate con SOCS3-siRNA e stimolate con insulina e IFN-a. Il silenziamento di SOCS3 non ha alcun effetto positivo sui livelli di mRNA dei geni ISGs analizzati (PKR: 3,28 + 0,43; OAS-1: 2,59 + 0,94; SOCS3: 1,43 + 1,22), se confrontati con il controllo [cellule trasfettate con non-targeting siRNA e trattate con insulina e IFN-a (controllo negativo) nelle quali l'over-espressione di SOCS3 è mantenuta come conseguenza dell'effetto dell'insulina (PKR: 3,10 + 0,19; OAS-1: 3,1+ 0,92; SOCS3: 7,3 + 0,98)]. Questi risultati dimostrano che la modulazione dell'attività antivirale dell' IFN-a, da parte dell'insulina, non è dovuta all'over-espressione di SOCS3. I nostri risultati dimostrano che l'insulina riduce, in modo dose-dipendente, l'espressione dei tre principali geni ISGs analizzati attraverso un meccanismo SOCS3-indipendente. Questi dati suggeriscono che i livelli di insulina potrebbero svolgere un ruolo cruciale nel ridurre la risposta alla terapia antivirale basata sull'uso dell'IFN. Questi dati sperimentali sono a supporto delle evidenze cliniche in quanto sottolineano che il controllo dei livelli basali di insulina prima dell'inizio della terapia con IFN-a rimane ad oggi la scelta migliore per aumentare la risposta antivirale.