Applicazione comparativa di metodiche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) nella diagnosi di Neurofibromatosi di tipo 1

La Neurofibromatosi di tipo 1 è la forma più comune di neurofibromatosi con una frequenza nella popolazione di 1 su 3000 nati vivi. La malattia presenta una trasmissione di tipo autosomico dominante e ha un’origine familiare soltanto nel 50% dei casi. Il restante 50% è causato da una mutazione de novo: ne deriva che la NF1 è una delle patologie a più alta frequenza di mutazioni insorte in maniera sporadica. La malattia è causata da mutazioni “loss of function” del gene NF1 che codifica per la neurofibromina, proteina coinvolta nella regolazione negativa della via di segnale di Ras. Le mutazioni a carico del gene NF1 sono estremamente numerose e di diversa tipologia: ad oggi ne sono state riportate oltre 1900 nel database LOVD (Leiden Open Variation Database). I difetti di splicing rappresentano il difetto molecolare più comune nella NF1: circa il 50% delle mutazioni puntiformi del gene NF1 causa l’alterazione dei siti di splicing con conseguente esclusione di uno o più esoni (exon skipping) o la ritenzione degli introni. L’analisi molecolare del gene NF1 per la ricerca di mutazioni è piuttosto complicata per diverse ragioni che includono le grandi dimensioni del gene, la presenza di pseudogeni altamente omologhi al gene NF1, la mancanza di hot spots mutazionali e il complesso spettro mutazionale. Ad oggi la diagnosi molecolare di NF1 si basa sul sequenziamento Sanger del gene a partire da mRNA e/o da DNA genomico. L’approccio tradizionale permette di ottenere dati di sequenza molto accurati ma risulta piuttosto laborioso, costoso e richiede tempi estremamente lunghi. Lo sviluppo di piattaforme di sequenziamento di nuova generazione (NGS) ha dato un nuovo impulso al mondo della biologia molecolare. La tecnologia NGS, che implementa un sistema dotato di maggiore processività per la lettura delle sequenze in parallelo, è in grado di produrre grandi quantità di dati riducendo i tempi e i costi impiegati. L’obiettivo di questo studio è stato verificare l’applicabilità di metodiche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per l’analisi del gene NF1 da introdurre nella pratica diagnostica di laboratorio. In particolare, sono stati adottati due diversi approcci di sequenziamento di nuova generazione basati sull’utilizzo di cDNA o di DNA genomico come materiale di partenza e sull’impiego della piattaforma MiSeq Dx (Illumina). Per lo studio sono stati analizzati 80 pazienti con diagnosi clinica, o sospetta diagnosi, di Neurofibromatosi di tipo 1. 24 pazienti sono stati analizzati a partire da cDNA mentre per 20 pazienti l’analisi è stata condotta da DNA genomico. Al fine di comparare le potenzialità delle due diverse metodiche nell’analisi del gene NF1, 36 pazienti sono stati sottoposti a sequenziamento NGS sia da cDNA che da gDNA. Le due metodiche hanno individuato complessivamente 22 mutazioni patogenetiche (22/36, 61,1%); nello specifico, l’analisi da gDNA ha rilevato tutte le 22 mutazioni, mentre l’analisi da cDNA ne ha individuate soltanto 16, dando un risultato negativo, o identificando una variante non corretta, in 6 casi. Per i soggetti risultati negativi all’analisi tramite sequenziamento NGS (14/36, 38,9%), l’indagine molecolare è proseguita con la ricerca di eventuali mutazioni patogenetiche tramite analisi Sanger da DNA o RNA o, alternativamente, tramite MLPA, così da escludere la presenza di delezioni/duplicazioni multiesoniche. In un solo caso il sequenziamento Sanger da DNA ha individuato una mutazione non identificata con le due metodiche. Analizzando i risultati in maniera retrospettiva, l’analisi da gDNA mostra una “detection rate” del 95,7% (22/23), con un solo risultato falso negativo. L’analisi da cDNA, invece, presenta una “detection rate” pari al 69,6% (16/23) con 7 risultati falsi negativi. Sebbene l’analisi da cDNA permetta di osservare direttamente gli effetti delle mutazioni di splicing, il sistema mostra alcune limitazioni bioinformatiche che non permettono una completa detection delle varianti. L’algoritmo di allineamento dello strumento elimina tutte le reads di sequenza che non si appaiano per più di 25 nucleotidi consecutivi alla sequenza di riferimento del trascritto del gene NF1; ne deriva che mutazioni di splicing che determinano nel trascritto delezioni superiori a 25 bp non vengono identificate. Questo aspetto potrebbe giustificare i risultati falsi negativi ottenuti dall’analisi da cDNA relativi all’identificazione di mutazioni introniche di splicing che con tutta probabilità determinano nel trascritto la perdita di numerosi nucleotidi. Al contrario, il sequenziamento NGS da gDNA mostra un workflow più lineare facilmente applicabile in campo diagnostico per l’analisi molecolare del gene NF1. L’utilizzo del DNA genomico come materiale di partenza rende la metodica più rapida, permettendo di processare parallelamente oltre 50 campioni, senza ulteriori step di preparazione. La sua applicazione si è rivelata estremamente sensibile e specifica, costituendo una buona strategia per la detection di mutazioni a partire da DNA genomico. In conclusione, le tecnologie di sequenziamento di nuova generazione rappresentano una valida strategia per l’analisi dei pazienti affetti da Neurofibromatosi di tipo 1, permettendo di ridurre notevolmente i tempi e i costi previsti per l’analisi di un gene complesso come NF1.