GABAergic interneuron communication to astrocytes: a novel modulatory signalling in brain networks

Gli astrociti hanno un ruolo centrale nella regolazione dell’attività e della plasticità dei circuiti neuronali. I processi astrocitari avvolgono le sinapsi e rispondono al rilascio neuronale di glutammato con significativi aumenti di Ca2+ intracellulare. Tali variazioni Ca2+, principalmente mediate da recettori metabotropici, regolano il rilascio di gliotrasmettitori che modulano sia la trasmissione eccitatoria che quella inibitoria. Tuttavia, mentre l’interazione tra astrociti e neuroni eccitatori è largamente studiata, la cooperazione tra neuroni inibitori ed astrociti rimane ancora inesplorata. L'inibizione sinaptica dipende da una varietà di interneuroni GABAergici che orchestrano l’attività spontanea e le risposte a stimoli sensoriali dei neuroni eccitatori, regolando anche lo sviluppo corticale e l’insorgenza, la propagazione e la cessazione dell’attività epilettica. L’interazione tra interneuroni ed astrociti rappresenta dunque un ulteriore livello di complessità computazionale nell’elaborazione dell’informazione nervosa ed un potenziale meccanismo alla base delle crisi epilettiche. L’obiettivo della mia tesi è di studiare la comunicazione tra astrociti ed interneuroni, valutando se gli astrociti siano in grado di rispondere al neurotrasmettitore GABA e come la loro risposta possa eventualmente influenzare l’attività neuronale. Per caratterizzare questa interazione, ho effettuato esperimenti di imaging del Ca2+ in fettine corticali caricate con l’indicatore del calcio FLUO-4 AM e per marcare selettivamente gli astrociti Sulforodamina-101. Il 60 % degli astrociti monitorati ha mostrato aumenti di Ca2+ somatico in seguito a somministrazione di GABA o baclofen (Bac), un’agonista specifico dei recettori GABAB. Tale risposta Ca2+ è abolita in topi KO per il recettore astrocitario dell’inositol-1,4,5-trifosfato (IP3). D’altra parte anche il blocco delle proteine Gi/q aboliva la risposta calcio mediata dal Bac. Questi risultati rivelano un coinvolgimento della cascata Gq/IP3 e suggeriscono una possibile interazione tra Gi/Gq nel segnale di risposta al GABA da parte degli astrociti. In un modello di animale transgenico in cui gli astrociti esprimono geneticamente il sensore del Ca2+ GCaMP3, applicazioni locali di GABA o Bac hanno indotto nei processi degli astrociti oscillazioni durature e sostenute del segnale Ca2+. Tale attività Ca2+ occasionalmente poteva propagarsi e coinvolgere l’intero astrocita. La responsività degli astrociti al signalling GABAergico è stata inoltre validata in esperimenti in vivo in animali adulti P30-60 esprimenti GCaMP3, dove applicazioni locali di Bac in SSCx LI/II, hanno evocato aumenti Ca2+ nel 45.46 % ± 8.07 % del totale degli astrociti monitorati. Ho confermato la selettività di questa risposta in esperimenti di optogenetica, esprimendo negli interneuroni GABAergici Parvalbumina-positivi (PV) o Somatostatina-positivi (SOM) il canale foto-attivabile channelrhodopsin-2. La foto-stimolazione simultanea e selettiva dei PV o dei SOM ha dimostrato che gli astrociti rispondono al rilascio sinaptico di GABA con aumenti di Ca2+ mediati dal recettore GABAB. Inoltre la scarica di potenziali di azione indotta in un singolo PV o in un SOM tramite una pipetta da patch recording, produce lo stesso effetto su scala locale. Ho inoltre studiato se gli astrociti, una volta attivati da GABA, siano in grado di rilasciare glutammato evocando lente correnti depolarizzanti (SICs, slow inward currents) nei neuroni. L’imaging del Ca2+ accoppiato a registrazioni da neuroni piramidali hanno rivelato che l’attività Ca2+, indotta dal GABA negli astrociti, provocava SICs. Infatti, esperimenti di controllo in topi IP3R2-KO non hanno rivelato un significativo aumento nel numero di SICs. Questi dati sono stati confermati anche tramite stimolazione di PV o SOM esprimenti ChR2 in cui, in seguito all’attivazione selettiva delle due classi di interneuroni, si è osservato un aumento significativo nella frequenza delle SICs. Questi dati dimostrano che gli astrociti, attivati dal GABA, sono in grado di convertire un episodio inibitorio transiente, ma intenso, in un lento aumento di eccitabilità nei circuiti locali. In conclusione, gli astrociti corticali sono attivati da due classi di interneuroni GABAergici e il conseguente rilascio di gliotrasmettitori rivela una nuova forma di controllo omeostatico dell’eccitabilità di network.