Caratterizzazione della regione carbossi-terminale della proteina strutturale GAG del virus dell'immunodeficienza felina (FIV)

Lo studio dei determinanti virali e cellulari che regolano il rilascio delle particelle retrovirali dalle cellule infettate riveste un ruolo cruciale sia nello studio della biologia di base del virus, allo scopo di identificare nuovi target terapeutici, sia nello sviluppo di vettori per il trasferimento di proteine/geni a scopo vaccinale/terapeutico. In tale contesto, la poliproteina Gag, espressa in assenza di ogni altra proteina virale, è in grado di produrre particelle simil virali (VLP). I virus ad RNA dotati di envelope gemmano dalle cellule infettate sfruttando il pathway del Multivesicular Body (MVB). In questo ambito, fondamentali sono l'ubiquitinazione delle proteine strutturali virali e la loro diretta interazione con fattori cellulari coinvolti nella biogenesi dei MVB attraverso corti motivi aminoacidici ricchi in prolina, noti come domini di assemblaggio tardivo (Late assembly domain o L domain). Il presente lavoro di dottorato si inserisce in un progetto di ricerca più ampio che si propone di ottimizzare la produzione delle proteine strutturali del Virus dell'Immunodeficienza Felina (FIV), al fine di migliorare l'ottenimento di VLP. In particolare, ci si è proposti di valutare aspetti quali produzione e maturazione delle particelle simil virali e di studiare le interazioni della proteina Gag con proteine cellulari che cooperano con la funzione dei motivi tardivi in essa contenuti. A tale scopo, è stata ottenuta una serie di costrutti FIV-derivati, esprimenti la proteina Gag mutagenizzata nella regione carbossi-terminale a livello dell'L domain, che com'è noto svolge un ruolo essenziale nelle fasi tardive della replicazione virale. In questo modo è stato possibile dimostrare come FIV, a differenza del Virus dell'Immunodeficienza Umana (HIV), è strettamente dipendente per la sua gemmazione dal dominio L PSAP, indipendentemente dalla funzionalità della proteasi virale. E' stato inoltre identificato un secondo putativo L domain con funzione ausiliaria, motivo LLDL, localizzato all'interno della regione p2 di Gag situato a valle rispetto al primo. E' stato possibile dimostrare come i suddetti domini L permettano a FIV di sfruttare il pathway cellulare di biogenesi dei MVB per gemmare in modo efficiente dalle cellule e di come tale fenomeno sia correlato ad una significativa ubiquitinazione di Gag, possibile solamente in presenza di un L domain attivo. In particolare è stato osservato come il blocco del pathway dei MVB, mediante la sovraespressione di un mutante dominante negativo della proteina cellulare Vps4, essenziale per la formazione dei MVB, porti ad una riduzione significativa nel rilascio di VLP anche in assenza di proteasi attiva. Inoltre, questo risultato è supportato dalla dimostrazione dell'incorporazione di Tsg101 nelle particelle virali e del coinvolgimento di CHMP3 nella gemmazione virale. Infine, sono state fornite interessanti evidenze che, sebbene FIV non possieda un dominio PPxY, l'ubiquitino ligasi Nedd4-2s aumenta il livello di ubiquitinazione della proteina Gag. Probabilmente, Nedd4-2s può cooperare con altri L domain per aumentare il rilascio virale o forse può portare all'ubiquitinazione e conseguente attivazione di componenti del MVB come dimostrato in questo studio avviene per Tsg101. Inoltre, questa particolare ubiquitino ligasi è in grado, senza venire incorporata nelle particelle virali, di ripristinare un efficiente rilascio di un mutante di FIV privo di un attivo L domain. In conclusione i dati ottenuti hanno permesso di chiarire alcune caratteristiche peculiari della regione carbossi-terminale della proteina Gag di FIV e più in particolare della fase di rilascio delle particelle virali. E' stato dimostrato come un lentivirus dei non primati condivida con HIV-1 un nuovo meccanismo di collegamento al macchinario cellulare di gemmazione.