Sviluppo di nuovi prodotti per terapia cellulare autologa

Recent years have been characterized by a revolution in biotechnological and biomedical research. A crucial role in this process is owed to advanced therapy medicinal products (ATMP). Good manufacturing practice (GMP) guidelines guarantee quality, safety and efficacy of ATMP by regulating the life cycle of a product. Critical limb ischemia (CLI) is the most severe form of peripheral arterial disease, characterized by ulcers and gangrene, leading to amputation and death. Implantation of cells with high angiogenic and vasculogenic capacity represents a promising approach to treat CLI. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are composed of lymphocytes and monocytes, inducing angiogenesis and arteriogenesis by secreting cytokines and growth factors, as well as contributing to inflammation and tissue regeneration. Many studies reported safety and efficacy of bone marrow mononuclear cells and PBMC. An advantage of PBMC is the easy collection of blood, compared to invasive bone marrow harvesting, making PBMC a valid candidate. Monocytes and macrophages are involved in post-ischemic neovascularization in hypoxic regions, regulated by hypoxia-inducible factor (HIF)-1 transcription factor. Hypoxic conditioning of PBMC is a therapeutic strategy worth considering, as it is known to increase the oxidative stress resistance and survival of implanted PBMC, resulting in improved angiogenic potential. The aim of the project was to develop a new product of autologous PBMC to treat patients affected by CLI that are not suitable for revascularization. The pre-clinical phase aimed to setup the isolation, cryopreservation and thawing protocols, to maximize cell count and viability of PBMC. ACD-anticoagulated blood was processed within 8 hours to isolate PBMC by density gradient centrifugation. Optimal cryopreservation was achieved with 11% DMSO in the freezing medium and with a controlled-rate freezing program. Immunophenotyping by flow cytometry provided the absolute count of all cell types in the product. To investigate a possible therapeutic strategy to enhance PBMC functional activity, hypoxic conditioning was performed with an economical and efficient system. A 24-hour conditioning at a density of 5 x 106 cells/ml did not alter PBMC quality, determined by visual inspection, cell count, viability and immunophenotyping in normoxic or hypoxic cultures. Functional activity of conditioned cells was evaluated with adhesion and migration assays, cell survival and production of reactive oxygen species (ROS) after oxidative stress, as well as mRNA expression of relevant genes. Hypoxic conditioning increased the adhesion and migration of PBMC, as well as their survival rate after oxidative stress. Similar ROS levels were measured after culture in both conditions, and a significant increase was induced by oxidative stress only in normoxic cells. Gene expression of hypoxic PBMC pointed out a significant upregulation of vascular endothelial growth factor (VEGF), the most relevant cytokine involved in new blood vessel formation. Relevant parameters of the manufacturing chain required a validation, in order to upgrade the process to a GMP-compliant facility and to ask for the production authorization. Optimal storage and transport conditions of blood were confirmed at room temperature for up to 8 hours. PBMC isolation, cryopreservation and thawing were performed in clean room according to manufacturing instructions. Isolation yield, viability and recovery rates were consistent with the research process. Long-term storage of frozen cells in liquid nitrogen confirmed high recovery rates and viability of thawed cells for 12 months. PBMC resuspended in 5% human albumin were stable for up to 24 hours when stored and transported at 4°C. Altogether, validations confirmed that the whole manufacturing process can be implemented for clinical application.

Gli ultimi anni sono stati caratterizzati da una rivoluzione nella ricerca biotecnologica e biomedica. Un ruolo cruciale in questo processo è dovuto ai medicinali per terapie avanzate (PMTA). Linee guida sulle buone pratiche di fabbricazione (GMP) garantiscono qualità, sicurezza ed efficacia dei PMTA regolando il ciclo di vita di un prodotto. L'ischemia critica degli arti inferiori (ICAI) è la forma più grave di malattia arteriosa periferica, caratterizzata da ulcere e cancrena, che porta all'amputazione e alla morte. Le cellule con elevata capacità angiogenica e vasculogenica rappresentano un valido approccio per il trattamento della ICAI. Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono composte da linfociti e monociti, che inducono angiogenesi e arteriogenesi secernendo citochine e fattori di crescita e contribuiscono all'infiammazione e alla rigenerazione dei tessuti. Molti studi confermano la sicurezza e l'efficacia delle cellule del midollo osseo e delle PBMC. Un vantaggio delle PBMC è la facile raccolta di sangue, rispetto al prelievo invasivo del midollo osseo, rendendo le PBMC un valido candidato. Monociti e macrofagi sono coinvolti nella vascolarizzazione post-ischemica, regolata dal fattore inducibile dall'ipossia (HIF)-1. Il condizionamento ipossico delle PBMC aumenta la resistenza allo stress ossidativo, la vitalità delle PBMC impiantate e il potenziale angiogenico. Lo scopo del progetto era sviluppare un prodotto di PBMC autologhe per trattare pazienti affetti da ICAI. La fase preclinica comprende i protocolli di isolamento, crioconservazione e scongelamento, per massimizzare il numero e la vitalità delle PBMC. Il sangue è stato processato entro 8 ore per isolare le PBMC mediante centrifugazione in gradiente di densità. La crioconservazione ottimale è stata ottenuta con l'11% di DMSO e con un programma di congelamento controllato. L'immunofenotipizzazione mediante citometria a flusso ha fornito il numero assoluto di tutti i tipi di cellule nel prodotto. Il condizionamento ipossico è stato eseguito per per migliorare l'attività funzionale delle PBMC. Un condizionamento di 24 ore a una densità di 5 x 106 cellule/ml non ha alterato la qualità delle PBMC, determinata mediante ispezione visiva, conteggio delle cellule, vitalità e immunofenotipizzazione in colture normossiche o ipossiche. La funzionalità delle cellule condizionate è stata valutata con dei test di adesione e migrazione, sopravvivenza e produzione di ROS dopo uno stress ossidativo, e l’espressione di mRNA di geni rilevanti. L’ipossia ha aumentato la capacità di adesione e di migrazione delle PBMC e il loro tasso di sopravvivenza dopo lo stress ossidativo. Livelli simili di ROS sono stati misurati dopo la coltura in entrambe le condizioni, e un aumento significativo è stato indotto dallo stress ossidativo solo nelle cellule normossiche. L’analisi delle PBMC ipossiche ha evidenziato un significativo aumento nell’espressione del fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), la citochina più importante nella formazione di nuovi vasi sanguigni. I parametri rilevanti della produzione richiedevano una validazione, per implementare il processo in un impianto conforme alle norme GMP e chiedere l'autorizzazione alla produzione. Le condizioni ottimali di trasporto del sangue sono state confermate a temperatura ambiente per un massimo di 8 ore. L'isolamento, la crioconservazione e lo scongelamento delle PBMC sono stati eseguiti in camera bianca secondo le istruzioni di produzione. Resa, vitalità e percentuali di recupero erano coerenti con il processo di ricerca. La conservazione a lungo termine in azoto liquido delle cellule congelate ha confermato alte percentuali di recupero e di vitalità delle cellule scongelate per 12 mesi. Le PBMC si sono rivelate stabili fino a 24 ore se conservate e trasportate a 4°C. L'intero processo di produzione può essere implementato per l'applicazione clinica.