Small diameter grafts for vascular tissue engineering

Nell’ingegneria tessutale vascolare, la formazione di un neo-tessuto è resa possibile dalla relazione tra: (1) scaffolds, biologici o sintetici, (2) cellule, sia seminate in vitro che reclutate in vivo, e (3) segnali, biochimici e biomeccanici. Tutti questi fattori sono interdipendenti e indispensabili per la formazione di un tessuto vascolare altamente organizzato. L’uso di scaffolds biologici o sintetici biodegradabili, su cui le cellule possano crescere, è un concetto che sta alla base dell’ingegneria tessutale classica. La presenza di un ambiente strutturato e funzionale è in grado di consentire la crescita e il differenziamento cellulare, in colture sia bidimensionali che tridimensionali. A questo proposito, la matrice extracellulare (ECM) si presta bene come scaffold per l’ingegneria tessutale, essendo ben strutturata e altamente organizzata. L’ECM, infatti, consiste in un complesso di proteine strutturali e funzionali che ricoprono un ruolo importante nella morfogenesi di organi e tessuti, nel mantenimento delle loro strutture e funzioni, e nella risposta da corpo estraneo. Essa è composta, tra l’altro, da collagene di tipo I, collagene di tipo VI, laminina, fibronectina, elastina, glicosaminoglicani, etc. In questo lavoro di Tesi, sono stati realizzati scaffolds vascolari di piccolo diametro sia biologici che “compositi” multi-strato. Gli scaffolds biologici acellulari a base di ECM sono stati realizzati mediante l’applicazione di un metodo di decellularizzazione detergente-enzimatico (protocollo di Meezan, leggermente modificato) ad arterie e vene tibiali bovine di piccolo diametro. Il metodo si è rivelato efficace nella rimozione della componente cellulare dai tessuti, e ne è stata indagata l’influenza sulla struttura e sulle proprietà meccaniche dei vasi studiati. A tale scopo, alcuni vasi biologici bovini sono stati non soltanto decellularizzati, ma anche rinforzati con un trattamento a base di poli(etilen glicole) diglicidil etere. Il metodo detergente-enzimatico ha consentito, dunque, la preparazione di sostituti acellulari vascolari (AVGs), preservando le componenti basilari della ECM e rimuovendo sia la componente cellulare sia l’antigene HLA di classe I, responsabile della reazione immunitaria da corpo estraneo. L’analisi istologica e morfologica ha confermato la capacità del protocollo di decellularizzazione Meezan di preservare l’istoarchitettura e numerosi componenti della ECM. Inoltre, il trattamento di cross-linking si è dimostrato in grado di rinforzare strutturalmente i costrutti acellulari, mostranti, dal punto di vista meccanico, valori comparabili a quelli dei vasi nativi bovini. Mimando la naturale architettura dei vasi sanguigni naturali, sono stati realizzati sostituti vascolari a tre strati (TLVGs). I vasi artificiali ingegnerizzati sono stati realizzati creando uno strato composto da acido poli(L-lattico) (PLLA), ricoperto internamente ed esternamente con proteine di ECM per supportare l’adesione cellulare. In questo caso, l’ECM utilizzata è stata ottenuta da aorta bovina, la quale è stata decellularizzata seguendo, ancora una volta, il protocollo Meezan. Per identificarne i componenti proteici presenti, la matrice extracellulare di aorta è stata sottoposta a elettroforesi bidimensionale, seguita dall’analisi LC-MS/MS delle bande proteiche ottenute. L’analisi proteomica ha evidenziato la presenza di collagene di tipo I e VI, vimentina, miosina, actina e tropomiosina. Sulla stessa matrice di aorta decellularizzata, l’analisi istologica ha evidenziato la presenza di proteoglicani, collagene e fibre muscolari. La tecnica di deposizione ‘a strati’ può essere considerata una metodica valida per l’ottenimento di scaffolds vascolari stratificati di differenti dimensioni e con un buon compromesso tra rigidezza ed elasticità per l’organizzazione ottimale delle cellule. Inoltre, lo strato intermedio microporoso in PLLA conferisce la resistenza meccanica necessaria a questo tipo di scaffold. La ECM aortica bovina è stata utilizzata anche come strato interno nei sostituti vascolari a doppio strato (BLVGs), rivestiti da idrogel di polivinil alcool (PVA). Il cambio di polimero ha consentito il miglioramento sia dell’elasticità che della suturabilità di questi costrutti rispetto a quelli a triplo strato. Gli idrogeli sono stati, inoltre, preparati utilizzando anche il PVA ossidato al fine di migliorare la loro biodegradabilità. Le proprietà meccaniche di AVGs, TLVGs e BLVGs sono state valutate mediante la misura della tensione uniassiale e hanno mostrato risultati comparabili ai valori dei vasi nativi, sia animali che umani. Il processo di decellularizzazione ha influenzato le caratteristiche fisiche di AVGs, quali il diametro e lo spessore delle pareti. Il diametro esterno e lo spessore delle pareti sono diminuiti nelle arterie acellulari rispetto a quelle native, mentre sono rimasti costanti nelle vene acellulari. Il trattamento di cross-linking con poli(etilen glicole) diglicidil etere, successivo a un breve trattamento proteolitico con tripsina, ha incrementato sia il modulo di tensione che la resistenza a rottura di AVGs (0.98 MPa e 3.95 MPa, rispettivamente) senza influire significativamente sulla deformabilità. Questi valori sono risultati comparabili a quelli di arterie e vene bovine native (attorno a 1 MPa). Il modulo di Young dei sostituti a triplo strato (1.8 MPa) si è rivelato, invece, comparabile a quello della vena safena o femorale umana (1.50 MPa), nonostante la microporosità dello strato in PLLA. La resistenza di uno scaffold fornisce, in genere, la solidità necessaria per resistere alle forze di contrazione cellulare, mentre l’elasticità consente una migliore comunicazione tra le cellule, facilitando la loro organizzazione. Lo strato in PLLA, avendo un opportuno grado di rigidità ed elasticità, ha anche assicurato il mantenimento di una forma tubulare nei costrutti a triplo strato. Questi risultati possono essere ritenuti interessanti per varie applicazioni nel campo dell’ingegneria tessutale, specie quando scaffolds e cellule interagiscono e si influenzano vicendevolmente nel mentre si integrano col tessuto ingegnerizzato. Le proprietà meccaniche, fisiche e chimiche del PVA parzialmente ossidato sono state, altresì, investigate. I tests meccanici hanno mostrato una maggiore elasticità dei costrutti in PVA (0.11 ± 0.03 MPa) rispetto a quelli a triplo strato, mostrando un decremento dell’elasticità al crescere del grado di ossidazione (1% e 2%). Inoltre, la calorimetria a scansione differenziale ha mostrato la presenza di cristallinità e un punto di fusione più bassi al crescere del grado di ossidazione del materiale. Il contenuto di gruppi carbonilici è stato valutato mediante il test con dinitrofenilidrazina. Al fine di testare la citocompatibilità di AVGs e TLVGs, cellule endoteliali umane isolate da cordone ombelicale (HUVECs) e cellule aortiche muscolari lisce umane (HAoSMC) sono state seminate in condizioni statiche in vitro sulle superfici interne ed esterne, rispettivamente, degli scaffolds realizzati. Dopo 7 giorni di coltura, gli AVGs decellularizzati e cross-linkati hanno mostrato di possedere una buona citocompatibilità, valutata effettuando esperimenti in vitro sia in condizioni statiche, utilizzando entrambe le tipologie cellulari citate su differenti scaffolds, sia in condizioni dinamiche, utilizzando soltanto le HAoSMCs in un bioreattore a rotazione costruito per lo scopo. La coltura di HAoSMCs sulla superficie esterna della matrice acellulare tubulare ha consentito la crescita cellulare in modo semplice e altamente efficace in condizioni dinamiche. Il bioreattore ha lavorato correttamente e in assenza di contaminazione durante l’intero periodo di coltura. Dopo 72 h, le HAoSMCs hanno formato un monostrato completo su tutta la matrice, disponendosi lungo la direzione di rotazione. Nei TLVGs, invece, gli strati di ECM hanno fornito stimoli adatti all’adesione e alla proliferazione cellulare e hanno supportato l’adesione e la crescita delle cellule endoteliali e delle cellule muscolari lisce, seminate per 7 giorni in co-coltura in vitro. Impianti in vivo di BLVGs su arterie femorali di ratti Sprague Dowley sono in corso e serviranno per testare l’efficacia dei costrutti. Al fine di investigare la relazione tra porosità e proprietà di scaffolds polimerici, è stato condotto uno studio in collaborazione con il gruppo di ricerca del Prof. Jockenhoevel presso l’Helmholtz Institute di Aachen (Germania) durante un periodo di stage di circa quattro mesi. Il progetto ha riguardato lo studio di caratterizzazione della fibrina umana, un polimero naturale, al fine di valutarne le proprietà fisiche e meccaniche in seguito ai cambiamenti chimici strutturali indotti. Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando fibrinogeni umani commerciali sia dializzati che non dializzati, a diverse concentrazioni. Dal punto di vista morfologico, il fibrinogeno a bassa concentrazione (5 mg/mL), indipendentemente dalla dialisi, determina la formazione di gels di fibrina caratterizzati da fibre più spesse e meno dense. Inoltre, la velocità di filtrazione, valutata con uno specifico bioreattore capillare, il CapNet system, è risultata maggiore nei gels di fibrina preparati con un fibrinogeno a bassa concentrazione (5 mg/mL) rispetto a quelli preparati ad una più elevata concentrazione di fibrinogeno (10 mg/ml). La dialisi, invece, ha influenzato il grado di separazione delle fibre di fibrina, attribuibile all’eliminazione di composti con peso molecolare al di sotto di 6000-8000 Dalton. Sono state studiate, inoltre, la velocità di degradazione e le proprietà meccaniche (es. lo sforzo a rottura per applicazione di una pressione) dei gels di fibrina. In particolare, i gels preparati con il fibrinogeno dializzato hanno mostrato una maggiore resistenza a rottura, incrementata ulteriormente dalla presenza di cellule seminate su di essi; mentre, dal punto di vista della valutazione della degradazione, non sono state osservate sostanziali differenze tra i gels di fibrina dializzati e non dializzati. La citocompatibilità di entrambe le tipologie di gels è stata testata, osservando l’ottimale adesione di cellule mesenchimali stromali seminate su di essi, risultante evidente nella compenetrazione cellulare attraverso le fibre di fibrina. Inoltre, sono state studiate le proprietà fisiche e meccaniche di scaffolds cilindrici in PCL con micro canali per una preliminare valutazione della loro capacità angiogenica. La velocità di filtrazione degli scaffolds in PCL con micro canali è stata valutata utilizzando il sistema CapNet. L’analisi morfologica degli scaffolds ha consentito di osservare la loro struttura mediante la microscopia a scansione elettronica. La capacità delle cellule endoteliali ovine di aderire e proliferare nei canali capillari, già presenti all’interno degli scaffolds in PCL, tenuti in coltura all’interno del CapNet system per 8 giorni, è stata osservata attraverso l’analisi immunoistochimica e la microscopia a scansione elettronica