Innovative technologies for the detection and control of rabies

La rabbia è un encefalomielite acuta causata da virus a singolo filamento di RNA a polarità negativa appartenenti al genere Lyssavirus, parte della famiglia Rhabdoviridae. Il virus si trasmette all’uomo da animale infetto, generalmente mediante morso. Il virus infetta il sistema nervoso centrale, mediante colonizzazione centripeta delle cellule nervose. L’infezione virale del sistema nervoso centrale è fatale nella maggioranza dei casi e dall’inizio della sintomatologia, che può essere catalogata in due forme: rabbia paralitica che determina la paralisi progressiva della vittima, o rabbia furiosa caratterizzata da aggressività, ipersalivazione ed insufficienza respiratoria acuta. Benchè le organizzazioni internazionali abbiano classificato tale malattia come una zoonosi altamente prioritaria, la rabbia è ancora trascurata nella maggiorparte dei Paesi in via di sviluppo. L’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) calcola che ogni anno almeno 10 milioni di persone ricevano il trattamento post-esposizione e stima una perdita di almeno 55.000 vite, la maggiorparte bambini in Asia e Africa (Knobel et al., 2005). Queste stime necessiterebbero sicuramente ulteriori conferme, alla luce dei risultati di diversi studi di modelling dei casi di rabbia altamente indicativi di un’incidenza superiore della malattia (Ly et al., 2009,Mallewa et al., 2007). Nonostante le gravi implicazioni per la salute pubblica, la rabbia rimane nella maggiorparte dei casi, sottostimata e poco diagnosticata nelle aree endemiche. A tal proposito, lo sviluppo di metodiche diagnostiche innovative, cosìccome lo studio delle dinamiche evolutive dei virus circolanti nelle specie reservoir della malattia, sono due strumenti utili sia per aumentare la sorveglianza sulla malattia sia per pianificare suoi nterventi di controllo. Il candidato ha sviluppato due test biomolecolari per la diagnosi della rabbia (One-Step RT-PCR) e la sua tipizzazione mediante l’utilizzo del pyrosequenziamento. La tecnica del pyrosequenziamento è una metodica alternativa al sequenziamento Sanger, che si basa sull’identificazione di una molecola di pirofosfato nel processo di sintesi del DNA (Nyren., 2007). Le due metodiche sono state sviluppate su due geni differenti del virus rabbia, N e G (codificanti per la nucleoproteina e per la glicoproteina rispettivamente). Nel primo caso, il protocollo ha permesso di identificare la specie virale responsabile dell’infezione, nel secondo invece di riconoscere la presenza di un virus vaccinale da un virus di campo. In particolare, la seconda metodica è stata applicata ai campioni risultati positivi per virus rabbia durante la recente epidemia in Nord Est Italia (2008-2011), durante la quale si è proceduto a vaccinazione orale delle volpi, mediante la distribuzione di esche vaccinali contenenti vaccino vivo attenuato. Le dinamiche epidemiologico-molecolari e le dinamiche evoluzionistiche dei virus rabbia circolanti nella regione centro-occidentale della Africa e più recentemente in Italia sono state affrontate durante la scuola di dottorato dal candidato. Le analisi filogenetiche si sono avvalse dei metodi massima verosimiglianza (programmi PAUP* e PhyML) (Wilgenbusch & Swofford., 2003, Guindon & Gascuel., 2003). Sono state inoltre analizzate le sequenze ottenute mediante Bayesian Markov Chain Monte Carlo (MCMC) disponibile nel programma BEAST (Drummond & Rambaut., 2007) per calcolare le dinamiche evolutive dei virus. Nel primo caso sono stati analizzati i virus circolanti nella regione centro-occidentale Africana. Lo studio ha dimostrato che i virus della rabbia circolanti nella popolazione canina dell’Africa Sub-Sahariana Occidentale e Centrale appartengono ad uno specifico sublineaggio detto Africa 2 Le analisi hanno dimostrato come questo specifico lineaggio sia stato verosimilmente introdotto in Africa in epoca relativamente recente (molto probabilmente 1845) e verosimilmente mediante il movimento di animali associati all’uomo (p.e. durante la colonizzazione francese della regione). Una forte caratterizzazione in cluster genetici circoscritti è inoltre indicativa di una circolazione relativamente limitata tra i Paesi all’interno della regione. Le sequenze dei virus rabbia responsabili della recente epidemia nel Nord-Est (2008-2011) sono state inoltre analizzate. I risultati ottenuti indicano che i virus responsabili della recente epidemia di rabbia silvestre appartengono al lineaggio Europeo Occidentale del clade Cosmopolita. In particolare, è stato possibile individuare due sub-clades virali con due pattern geografici distinti. Entrambi i sub-clades presentano un’elevata omologia con i ceppi circolanti nei Balcani in particolare nelle aree confinanti dell’ex-Yugoslavia e le analisi evoluzionistiche effettuate sono fortemente indicative di una duplice introduzione degli stessi in un’area ed in un arco temporale ristretti.