Il topo knock out per calsequestrina 1 (CASQ1): adattamento morfologici e funzionali dei muscoli fast twitch e reversione del fenotipo mediante elettroporazione in vivo

L’ampiezza dei transienti di Calcio e l’ultrastruttura delle unità di rilascio di Calcio (CRUs) sono significativamente alterate nelle fibre di muscolo EDL come già illustrato in Paolini et al., 2007. Rimane ancora da determinare se queste alterazioni siano direttamente conseguenti all’ablazione della CASQ1 o siano in parte dovute ad altri adattamenti compensatori. Lo scopo della mia tesi di Dottorato è verificare se la reintroduzione della CASQ1 in un muscolo FDB (flexor digitorum brevis) CASQ1-null sia in grado di revertire il fenotipo null. Il muscolo FDB CASQ1-null è stato preliminarmente caratterizzato confrontato al WT (wild type) sia dal punto di vista di composizione delle principali proteine dell’SR, sia dal punto di vista morfologico e del rilascio di Calcio. Nel muscolo FDB l’assenza della CASQ1 è associata a diminuzione significativa di CASQ2, Triadina 95, Sarcalumenina e Serca 1. Le alterazioni strutturali comprendono cisterne appiattite e svuotate di contenuto, anomala proliferazione del Reticolo giunzionale, orientamento longitudinale delle triadi e raddoppio dei canali RyRs. Difetti a carico del rilascio di Calcio dall’SR si osservano nel CASQ1-null sia nelle stimolazione a bassa che alta frequenza: l’altezza del picco di Calcio diminuisce significativamente a 0,5 Hz e le fibre non riescono a sostenere il rilascio prolungato a 60 Hz. Per revertire il fenotipo CASQ1-null si è reintrodotta nell’FDB CASQ1-null la CASQ1 veicolata da un vettore plasmidico, mediante elettroporazione in vivo. La microscopia elettronica (ME) dimostra che il volume delle cisterne terminali viene ripristinato e il Reticolo giunzionale risulta riempito di materiale elettrondenso, tipico aspetto della CASQ1 in ME. Anche se non si osservano variazioni nell’espressione proteica di CASQ2, Triadina 95, Sarcalumenina e Serca1 i transienti di Calcio a 0,5 Hz aumentano rispetto ai controlli trasfettati con vettore senza CASQ1. Inoltre il livello di Calcio citosolico rilasciato viene mantenuto durante la stimolazione ad alta frequenza dopo l’espressione della CASQ1, e l’SR riacquista le capacità di store e di rilascio del WT. Questi risultati dimostrano che la CASQ1 è direttamente implicata nel controllo del volume della cisterna e modula il rilascio di Calcio dall’SR. La seconda parte riguarda invece lo studio dei pathway proteolitici nel muscolo EDL CASQ1-null durante lo sviluppo, l’età adulta e la senescenza. Durante lo sviluppo si è preliminarmente descritto l’andamento di CASQ1 nel muscolo WT e di CASQ2 nel WT e CASQ1-null da 2 giorni a due mesi, osservando una diminuzione maggiore e temporalmente accelerata dell’isoforma cardiaca nel CASQ1-null. Si è descritta la precoce manifestazione dell’atrofia delle fibre CASQ1-null, già a partire da 11 giorni, e l’insorgenza dello stato di stress del Reticolo da 1 mese dopo la nascita, valutato come aumento dei chaperoni BiP, Calreticulina e GRP94. Il muscolo EDL CASQ1-null adulto presenta diminuzione del 20% a carico dell’area di tutti i tipi di fibra e l’attivazione del sistema ubiquitina Proteasoma (caratterizzato mediante western blots delle proteine ubiquitinate, Atrogin e MuRF1), aumentato potenziale autofagico (valutato mediante l’aumento di LC3 I e II) e upregolazione delle procaspasi 3, 9 e 12: risulta inoltre manifesto lo stato di stress del Reticolo. A 4 mesi il raddoppio del numero di mitocondri e del loro volume, valutati mediante ME, si associa ad elevata mitocondriogenesi descritta dall’aumento di PGC1-α. Nel muscolo EDL CASQ1-null anziano si assiste intorno ai 25 mesi a saturazione dei sistemi proteolitici dell’ubiquitina Proteasoma (con diminuzione dei markers caratteristici) ed autofagico (con presenza di autofagosomi anomali), e a comparsa, a 30 mesi, di cores composti da Reticolo, Tubuli T, e proteine contrattili degenerate. La diminuzione significativa di PGC1-α e quindi il blocco della mitocondriogenesi nel CASQ1-null è confermato dell’assenza dei mitocondri in alcune zone e dal loro aspetto danneggiato: la proliferazione mitocondriale potrebbe essere l’adattamento che a lungo termine determina, mediante l’aumento nella produzione di ROS, l’aggravarsi del danno nell’anziano. Il progressivo danneggiamento dei muscoli di tipo Fast twitch privi di CASQ1-null dipende con ogni probabilità alla sua origine dal disturbo dei segnali di Calcio che causa uno sviluppo compromesso, progressiva saturazione dei sistemi catabolici e insorgenza di miopatia core-like.