Targeting delle vie metaboliche dell'Epidermal Growth Factor (EGF), Adrenomedullina (ADM) ed Endotelina (ET-1) nelle linee stabilizzate di leucemia mieloide acuta (LMA)

RIASSUNTO L’outcome della leucemia mieloide acuta (LMA) non ha subito significativi miglioramenti nonostante la sempre più accurata descrizione dei meccanismi patogenetici che sottendono la trasformazione neoplastica della cellula staminale ematopoietica. Il blocco maturativo è caratteristica distintiva di tutte le leucemie acute e verosimilmente la presenza di una quota minoritaria di cellule a fenotipo più immaturo è responsabile di chemioresistenza e relapse. La prospettiva di poter utilizzare strategie farmacologiche volte a superare il blocco differenziativo, incoraggiata dal successo ottenuto nella leucemia acuta promielocitica con l'introduzione nei protocolli di terapia dell'acido all-trans retinoico, diventa alquanto attraente. Con questo obiettivo è stato proposto un modello sperimentale in vitro che vede l’utilizzo di linee cellulari stabilizzate di LMA, in particolare KASUMI-1 provenienti dalla banca tedesca DSMZ, tre ceppi HL-60 (HL-60 TV dall’università di Padova, HL-60 CRO dall’ospedale CRO di Aviano e HL-60 BANCA dalla banca tedesca DSMZ), dei peptidi Adrenomedullina (ADM), Endotelina-1 (ET-1) e dei loro rispettivi inibitori (ADM-fragment22-52 inhibitor, BQ123 e BQ788), del fattore di crescita dell’epidermide (EGF - Epidermal Growth Factor) e del suo inibitore indiretto (Gefitinib) a diverse concentrazioni. Tutti i ceppi HL-60 e la linea KASUMI-1 sono stati caratterizzati da un punto di vista immucitochimico e immunofenotipico. Queste analisi hanno evidenziato una diversità tra i ceppi sotto tutti i profili, anche nel tempo di duplicazione durante la crescita. Questo spiegherebbe il fatto che risultati discordanti in letteratura potrebbero essere originati da ceppi cellulari utilizzati nei diversi laboratori che possono differire anche in maniera significativa nelle loro caratteristiche biologiche, con eventuali meccanismi di selezione clonale e possibili ripercussioni sulla risposta allo stimolo farmacologico. Gli esperimenti sono stati condotti in parallelo su tutte le linee esponendole a concentrazioni decrescenti di ADM (5x10-8M, 2.5x10-8M, 1.25x10-8M e 0.625x10-8M; ET-1 (5x10-8M, 2.5x10-8M, 1.25x10-8M e 0.625x10-8M) ed EGF (10mg/microl, 5mg/microl, 2.5microg/ml e 1.25microg/ml). Il processo è stato valutato anche in relazione al tempo: 24h, 48h e 72h di esposizione. I risultati mostrano un potere stimolante di tutti e tre i peptidi in relazione alla dose e al tempo di somministrazione, con minime differenze tra i ceppi utilizzati. Gli effetti dei peptidi sono stati confermati dai risultati ottenuti utilizzando i loro rispettivi inibitori. ADM-fragment22-52 Inhibitor non esercita alcun effetto sui ceppi HL-60 e sulla linea KASUMI-1 singolarmente ma accoppiato ad ADM ne blocca la capacità proliferativa: gli effetti inducenti di ADM sono annullati dall’aggiunta ai terreni di coltura del corrispettivo inibitore. Allo stesso modo gli inibitori BQ123 e BQ788 dell’Endotelina da soli non esercitano alcun effetto sulle cellule mentre annullano il potere inducente di ET-1 in tutte le linee stabilizzate di LMA. Gefitinib esplica in vitro attività antiproliferativa con effetto citossico e citostatico a concentrazioni terapeuticamente raggiunte nell'attuale impiego clinico del farmaco, in particolare nel trattamento delle neoplasie di origine epiteliale. Questa indagine è stata effettuata mediante una sperimentazione preliminare articolata su test citotossici a breve termine associati a test di recupero in terreno semisolido e su indagini morfologiche ed immunofenotipiche. Le osservazione microscopiche confermano tali risultati, ma evidenziano che l’attività antiproliferativa di Gefitinib è dose dipendente e si realizza con modalità differenti nei diversi ceppi. Nei saggi colturali a breve termine, l’analisi statistica ha rivelato che anche il DMSO utilizzato come solvente del farmaco esercita una azione antiproliferativa. Gli effetti a lungo termine del Gefitinib sono stati testati come numero medio di CFU sviluppatesi post esposizione al farmaco in un terreno semisolido uguale per tutti i dosaggi. Le osservazioni morfologiche condotte su preparati allestiti al termine dei saggi colturali a breve termine non evidenziano, ai dosaggi più bassi, alcun fenomeno di segmentazione e/o banded a carico dei nuclei, tipico della differenziazione del promielocita in mielocita, metamielocita e granulocita maturo che caratterizza il processo di maturazione di questa filiera ematopoietica. Anche le indagini citofluorimetriche non mostrano variazioni qualitative del fenotipo di tutti i ceppi, post esposizione al farmaco. Essenziale per il commitment e lo sviluppo emopoietico in senso granulocitario è il ruolo esercitato da C/EBPalfa proteina appartenente alla famiglia dei fattori di trascrizione bzip (basic leucine zipper protein), in grado di formare omodimeri o eterodimeri con altre proteine C/EBP e attivare così la trascrizione di geni target (G-CSF receptor). La principale funzione di questa proteina sembra essere quella di bilanciare la proliferazione e la differenziazione cellulare regolando il self-renewal del pool staminale ematopoietico. E’ chiaro che se C/EBPalfa rappresenta un comune denominatore in pazienti affetti da leucemia acuta mieloide (con o senza alterazioni cromosomiche associate), strategie terapeutiche dirette alla correzione di questo pathway possono rappresentare una razionale prospettiva terapeutica. Per questo motivo sono stati iniziati degli studi sul ceppo HL-60 TV con metodica Real Time PCR sulle cellule in condizioni basali, dopo incubazione a breve termine con Gefitinib alla concentrazione di 2.5microM (la più alta in grado di dare effetto citostatico, ma non citotossicità) e nei controlli incubati con DMSO e in coltura di mantenimento. Consensualmente alle osservazioni morfologiche ed immunofenotipiche, Gefitinib non induce up-regolazione di C/EBPalfa. Pertanto, questi dati, se considerati nel loro complesso, suggeriscono che ADM ed ET-1 contribuiscono alla proliferazione delle cellule di LMA, azione fortemente ridotta dai rispettivi inibitori, mentre EGF esercita minimi effetti induttivi sulle cellule. Alla luce di tali considerazioni è possibile ritenere che AM ed ET-1 siano due nuove promettenti molecole regolatorie dei processi ematopoietici.