HD-ZIP III transcription factors regulate ACL5 and participate with this gene in a regulatory loop controlling vascular development in Arabidopsis thaliana (L.) Heynh

RIASSUNTO I numerosi dati genetici accumulati indicano che i 5 membri della famiglia HD-ZIP III della pianta modello Arabidopsis thaliana sono coinvolti nella regolazione dell’attività dei meristemi, nella formazione della polarità degli organi laterali e dei fasci vascolari, e nel differenziamento del sistema vascolare con una complessa combinazione di funzioni ridondanti, sinergiche e contrastanti. Questi processi di sviluppo rappresentano delle innovazioni fondamentali acquisite durante l’evoluzione delle piante terrestri ed è stato suggerito che i geni della famiglia HD-ZIP III, che presentano una notevole conservazione filogenetica, siano stati tra i primi componenti chiave dei circuiti regolativi che hanno permesso l’evoluzione di un’ampia varietà di specie vegetali adattate alla vita fuori dall’ambiente acquatico. L’attività dei fattori di trascrizione HD-ZIP III è strettamente controllata a diversi livelli attraverso una molteplicità di meccanismi che comprendono la omo- ed etero-dimerizzazione, l’interazione proteina-proteina e la regolazione da parte dei miRNA e di piccole molecole come l’ormone auxina e un ligando lipidico la cui natura non è ancora nota. Per far luce sul meccanismo d’azione dei fattori di trascrizione HD-ZIP III, ci si é proposti di ricercare i geni direttamente regolati da queste proteine. Utilizzando un approccio bioinformatico sono stati identificati nel genoma di Arabidopsis 390 geni contenenti il sito di legame delle proteine HD-Zip III (BS-III). Tra questi, è stata notata la presenza del gene ACAULIS5 (ACL5), codificante per la termospermina sintetasi, che presenta una significativa sovrapposizione funzionale e di espressione con i geni della famiglia HD-ZIP III. Esperimenti di legame in vitro e analisi di espressione hanno fornito una prima conferma sperimentale all’ipotesi che ACL5 sia un autentico gene target della famiglia HD-ZIP III. L’oggetto di questa tesi è stato quindi la verifica in vivo della regolazione di ACL5 da parte della famiglia HD-ZIP III e lo studio della relazione tra questi geni nella regolazione dello sviluppo del sistema vascolare in Arabidopsis. Per verificare in vivo la rilevanza funzionale del sito di legame della famiglia HD-ZIP III nel promotore di ACL5 sono state generate piante transgeniche di Arabidopsis esprimenti la sequenza codificante di ACL5 fusa alla sequenza codificante il reporter GUS sotto il controllo del promotore di ACL5 nella versione selvatica o mutata nell’elemento BS-III in modo da abolire il legame delle proteine HD-ZIP III. L’analisi istochimica del profilo d’espressione del reporter GUS ha mostrato che l’espressione di ACL5 è preceduta da quella di ATHB8, un membro della famiglia HD-ZIP III la cui espressione è necessaria per definire l’identità pre-procambiale delle cellule, e che la mutazione dell’elemento BS-III abolisce l’espressione di ACL5 negli stadi più precoci del differenziamento del procambio nei primordi fogliari, nell’apice radicale e nei primordi delle radici laterali. Questo risultato rafforza l’ipotesi che ACL5 sia un target autentico regolato direttamente dalle proteine HD-ZIP III attraverso il legame all’elemento BS-III. Per verificare ulteriormente il ruolo funzionale dell’elemento BS-III in vivo, i costrutti ACL5::ACL5:GUS e ACL5mut::ACL5:GUS sono stati introdotti anche nel mutante acl5-1. L’analisi fenotipica di queste piante transgeniche ha mostrato che la mutazione del promotore non impedisce la complementazione di tutte le alterazioni fenotipiche del mutante acl5-1. In modo inatteso, l’analisi dettagliata della nervatura delle foglie di queste piante ha permesso di estendere la caratterizzazione funzionale di ACL5 suggerendo che il differenziamento dello xilema è correlato al livello di ACL5. Infatti, sebbene sia stato dimostrato che ACL5 è necessario per permettere il corretto sviluppo vascolare impedendo la morte prematura delle cellule dei vasi, i dati presentati qui indicano chiaramente che alti livelli di ACL5 possono ritardare o inibire completamente il differenziamento delle cellule procambiali in elementi xilematici maturi. Durante questo studio, inoltre, sono stati descritti dei nuovi fenotipi del mutante acl5-1, come l’iponastia delle foglie, l’alterazione dello sviluppo radicale, l’accumulo di antocianine e l’anticipo della fioritura, che hanno permesso di estendere la caratterizzazione funzionale di ACL5 suggerendo un ruolo per questo gene nel controllo della proliferazione cellulare e nelle risposte da stress oltre che nel controllo del differenziamento vascolare. Infine un’attenta caratterizzazione fenotipica di mutanti doppi e multipli ottenuti dall’incrocio di acl5-1 con mutanti dei geni HD-ZIP III ha mostrato che, sebbene acl5-1 sia epistatico su rev-5 rispetto all’allungamento del fusto, alla dimensione della rosetta e alla fertilità, alcune difetti del mutante acl5-1 sono compensati dalla perdita di funzione dei geni HD-ZIP III, indicando che questi partecipano anche ad alcuni degli eventi regolativi a valle dell’azione di ACL5. In particolare, i geni HD-ZIP III sono necessari nel mutante acl5-1 per permettere la formazione di nervature extranumerarie e per sostenere il circuito di regolazione a feedback negativo che regola l’espressione di ACL5. Infine, poiché è noto che ACL5 influenza l’espressione dei geni HD-ZIP III, è stato proposto un modello di regolazione a feedback secondo il quale la progressione del differenziamento delle cellule procambiali é regolata dall’auxina e dai fattori di trascrizione HD-ZIP III attraverso l’induzione di un reostato enzimatico, costituito dalla proteina ACL5 e dal suo prodotto termospermina, che a sua volta modula i livelli di espressione dei geni HD-ZIP III.