Cyclic nucleotide signalling interplay in rat neonatal cardiac myocytes: FRET-based targeted biosensors reveal compartment-specific modulation of cAMP levels by cGMP

Nel cuore, i secondi messaggeri cAMP e cGMP mediano gli effetti di diversi ormoni e neurotrasmettitori e regolano la la forza e la frequenza cardiaca. cAMP e cGMP, inoltre, costituiscono bersagli chiave nel trattamento di diverse patologie cardiache. In vitro, cGMP modula l'attivita' enzimatica delle fosfodiesterasi 2 e 3 (PDE2 e PDE3), enzimi responsabili della degradazione di cAMP. In particolare, cGMP attiva la PDE2 agendo su siti allosterici di legame denominati domini GAF, e inibisce la PDE3 agendo da inibitore competitivo. cGMP puó quindi agire come modulatore dei livelli intracellulari di cAMP. Nel presente lavoro di tesi ė stato investigato, in colture primarie di cardiomiociti di ratto, come cGMP, agendo su PDE2 e PDE3, influenza le vie di segnale mediate da cAMP a livello di singoli compartimenti subcellulari. In particolare ci siamo focalizzati nei compartimenti che ospitano le due isoforme di PKA (PKAI e PKAII). Le variazioni intracellulari di cAMP e cGMP sono state monitorate usando biosensori fluorescenti basati sul FRET indirizzati in questi due compartimenti. Esperimenti di real time imaging in cardiomiociti hanno evidenziato che il cGMP generato dalla forma solubile o particolata di guanilato ciclasi ha effetti diversi sulla risposta beta-adrenergica. L'attivazione della forma particolata di guanilato ciclasi ad opera di donatori di ossido nitrico porta ad una inversione dei gradienti di cAMP nei due compartimenti in risposta ad isoproterenolo. Questa effetto é dovuto alla modulazione compartimento-specifica delle PDE che prevede l’attivazione di PDE2 nel compartimento che ospita PKAII e l’inibizione di PDE3 nel compartimento che ospita PKAI. La modulazione dei livelli di cAMP da parte di cGMP si traduce in una differente attivazione delle due isoforme di PKA e in una alterazione della fosforilazione di bersagli di PKA. Al contrario, l’attivazione della guanilato ciclasi particolata modifica i livelli di cAMP solo nel compartimento PKAII dove il cGMP, attivando la PDE2, attenua la generazione di cAMP in risposta a isoproterenolo. Questi risultati evidenziano un complesso interplay tra le vie di segnale mediate da cAMP e cGMP che si risolve in effetti diversi a seconda del compartimento subcellulare interessato.