Study of the mechanism of action of snake myotoxins

Gli avvelenamenti da morso di serpente costituiscono un importante problema di salute mondiale, specialmente nei paesi tropicali e subtropicali. In particolare, nell’ America Latina, il genere Bothrops è responsabile del 50-90% degli incidenti. La sieroterapia è in grado di contrastare tutte le manifestazioni sistemiche del veleno, ma non gli effetti locali quali la mionecrosi diffusa causata da miotossine con attività di fosfolipasi A2, componenti principali del veleno dei serpenti del genere Bothrops. Le miotossine PLA2 sono divise in due principali gruppi, quelle con un acido aspartico nella posizione 49 che hanno attività catalitica (Asp49 PLA2) e quelle dove una lisina sostituisce l’acido aspartico nella stessa posizione causando la perdita della capacità di idrolizzare i fosfolipidi (Lys49 PLA2). Nonostante i tanti studi, il meccanismo d’azione delle miotossine è poco noto; chiarire a livello molecolare come agiscono sul muscolo questo tipo di tossine è stato il principale obiettivo di questo lavoro. A questo scopo è stata utilizzata la linea cellulare C2C12 come modello di cellule muscolari per allestire esperimenti con tecniche di imaging del calcio e determinazione della vitalità cellulare. Nel primo capitolo, si mostra come i due tipi di miotossine (Asp49 e Lys49 PLA2s) si comportano come ligandi di accettori accoppiati agli stores intracellulari di calcio, e che le miotossine PLA2 inattive Lys49 e le PLA2 attive Asp49 agiscono con differenti meccanismi che conducono comunque ad ingresso di ioni calcio nella cellula muscolare differenziata. In questo lavoro si riporta per la prima volta la cinetica d’azione dei due gruppi di tossine, e la scoperta importante che la miotossina PLA2 non enzimaticamente attiva sinergizza con la miotossina PLA2 attiva mostrando il significato evolutivo per la presenza di tutte e due tipi di tossine nello stesso veleno del serpente. Il secondo capitolo porta nuove evidenze a favore del ruolo essenziale del C-terminale delle miotossine PLA2 Lys49. Di fatto, questa regione della molecola è coinvolta nella permeabilizzazione della membrana. Quindi, la regione C-terminale delle miotossine Lys49 è capace di causare un estensivo e veloce influsso di calcio portando la cellula muscolare alla morte in pochi minuti. Nel terzo capitolo viene analizzata una miotossina atipica di Bothrops jararacussu, bothropstoxin-II. Pur essendo una tossina del gruppo Asp49 ha un’attività PLA2 molto ridotta rispetto alle altre Asp49 PLA2s, addirittura confrontabile con le Lys49 omologhe. Oltre a questo, BthTX-II agisce anche in assenza di calcio nel buffer, diversamente da tutte le Asp49 studiate fino ad ora. Si è dimostrato, per la prima volta, che una miotossina Asp49 atipica è capace di perturbare la membrana plasmatica dei miotubi portando alla morte cellulare sia in presenza che in assenza di ioni calcio extracellulari. Nel quarto capitolo, si descrive una parte di lavoro ancora non pubblicata in cu si è studiato il rilascio, indotto da queste tossine, di molecole intracellulari, capaci di segnalare una situazione di pericolo da parte delle cellule danneggiate. È stato mostrato che la myotoxin-II di B. asper induce rilascio di ATP e che esso è responsabile di una amplificazione della mionecrosi. Parallelamente è stato osservato un veloce e significativo efflusso di potassio che può essere coinvolto nella generazione di stimoli dolorifici e nell’attivazione di meccanismi pro infiammatori. Questi risultati contribuiscono a spiegare il quadro infiammatorio che si osserva negli avvelenamenti da Bothrops.