Analysis of the role of the homeobox transcription factor PITX2 in cardiac development: a conditional ko approach

Pitx2 è un fattore di trascrizione homeobox espresso durante l’embriogenesi e determinante per lo sviluppo di diversi organi tra cui gli occhi, i denti, la ghiandola pituitaria e il cuore (Gage et al., 1999). In aggiunta al suo ruolo morfogenetico , Pitx2 agisce a valle della cascata di attivazione del segnale che determina il conferimento dell’identità sinistra negli organi asimmetrici (Levin et al., 1995; Isaac et al., 1997; Logan et al., 1998; Ryan et al., 1998). Entrambe queste due azioni vengono svolte in maniera integrata durante lo sviluppo del cuore, organo asimmetrico nel quale il gene viene espresso fin dalla formazione del primordio del cuore e nel corso di tutto il suo successivo sviluppo (Campione et al., 2001). Sebbene sia chiara la centralità della funzione di Pitx2 nello sviluppo cardiaco, i meccanismi tramite i quali esso è in grado di dirigere la sua morfogenesi asimmetrica non sono stati compresi. Ad oggi, non è ancora stato ancora descritto un buon modello murino per lo studio del gene nel contesto della morfogenesi cardiaca. Per discernerne il ruolo miocardico, abbiamo quindi generato un modello murino di ko condizionale incrociando una linea di topi con l’omeodominio di Pitx2 fiancheggiato da siti LoxP (Pitx2 loxP/loxP) (Gage et al., 1999) e una linea esprimente la Cre ricombinasi sotto il controllo trascrizionale del promotore della troponina T cardiaca (TnT) (Jiao et al., 2003). I topi cTP ottenuti da questo incrocio mostrano un elevata attività della ricombinasi fin da fasi molto precoci dell’embriogenesi, che consente la completa inattivazione funzionale del gene già dai momenti iniziali della cardiogenesi. La caratterizzazione del modello cTP è stata oggetto del seguente studio; poiché i cTP ko hanno un fenotipo letale, il lavoro è stato condotto su embrioni. L’analisi istologica e mediante risonanza magnetica di cuori mutanti E14.5 ha rivelato un fenotipo complesso, composto da una serie di gravi anomalie cardiache tra cui l’isomerismo atriale destro (IAD), una condizione patologica in cui entrambi gli altri si sviluppano secondo le caratteristiche morfologiche e instaurando le connessioni venose di quello destro; questo implica, tra le altre cose, lo sviluppo di due nodi seno atriali (NSA) e l’ingresso bilaterale delle vene cave destra e sinistra nei rispettivi atri. L’analisi morfologica è stata affiancata da un’estensiva analisi molecolare condotta prevalentemente mediante ibridazione in situ non radioattiva, allo scopo di valutare eventuali alterazioni del profilo trascrizionale del modello. La presenza di un secondo nodo ectopico e l’aver verificato un’alterata espressione di marcatori di sviluppo del sistema di conduzione ventricolare ci ha suggerito di investigare le proprietà elettrofisiologiche dei cuori embrionali. A tale scopo abbiamo adottato la metodica dell’optical mapping, conducendo uno studio in collaborazione con il Prof. David Sedmera (dell’Istituto di Fisiologa Animale e Genetica di Praga); la tecnica consente la registrazione dell’attivazione elettrica dell’epicardio del cuore con un’elevatissima risoluzione spaziale e temporale e la costruzione di mappe di attivazione del segnale che riproducono dove si generi e come si propaghi l’impulso stesso. Poiché i ventricoli non mostravano alterazioni drammatiche della morfologia in assenza del gene, abbiamo infine effettuato un’analisi al confocale, allo scopo di evidenziare eventuali azioni cellulari del gene. Lo studio qui presentato ha condotto alle seguenti conclusioni: 1 I topi cTP ko sono un buon modello di IAD giacché, in assenza del gene, la regione senoatriale destra si sviluppa secondo la morfologia della sinistra. L’ IAD è uno dei tratti che rendono il fenotipo dei cuori cTP assimilabile a quello descritto in un ko costitutivo per Pitx2 caratterizzato in passato (Gage et al., 1999); l’IAD era invece completamente assente in un modello di ko condizionale generato più recentemente da Tessari et al. Tale modello differisce dal cTP per la cinetica di attivazione del promotore α-MHC che guida l’espressione della ricombinasi (Tessari et al., 2008): nei topi α-MHC, l’inattivazione di Pitx2 avviene con un giorno di ritardo rispetto ai cTP. Nel loro complesso, i nostri risultati indicano che l’espressione precoce di Pitx2 nelle cellule miocardiche, e non nei loro precursori mesenchimali, è una condizione necessaria e sufficiente per conferire identità “sinistra” alla regione senoatriale. 2 Pitx2 modula le proprietà trascrizionali del miocardio che circonda le vene cave e le vene polmonari: In assenza di Pitx2 si osserva la mancata repressione trascrizionale (nelle vene cave) o l’attivazione ectopica (nelle vene polmonari) di un programma genetico di tipo nodale, che comprende l’espressione di un canale del potassio, Hcn4, potenzialmente sufficiente a conferire autoritmicità ai tessuti (Stieber et al., 2003). In linea con tali osservazioni, l’analisi mediante optical mapping mostra che l’espressione del gene modula l’attività pacemaker del polo venoso del cuore in modo dose-dipendente. L’alterato profilo trascrizionale delle vene è un esempio di come l’attività di Pitx2 non si limiti alla morfogenesi (e quindi alla costruzione di strutture) ma si esplichi anche attraverso il conferimento di un’identità “sinistra” di tipo molecolare; la modulazione trascrizionale e l’azione morfogenetica possono essere svolte in modo concomitante e coordinato, oppure disgiunto e indipendente nel corso dello sviluppo. Le osservazioni condotte a livello delle vene dei mutanti cTP si inseriscono in un dibattito scientifico di acceso interesse circa il ruolo di Pitx2 nell’insorgenza della fibrillazione atriale (AF); alla luce di quanto osservato, la nostra opinione è che alterazioni dell’espressione di Pitx2 possano determinare l’insorgenza di attività pacemaker ectopica in vene cave e vene polmonari. La presenza di foci ectopici di attivazione elettrica rappresenta uno dei meccanismi meglio descritti nella patogenesi della fibrillazione atriale (Allessie et al., 2001; Nattel et al., 2002). 3 I cardiomiociti ventricolari ko per Pitx2 appaiono meno allungati e possiedono un minor grado di allineamento delle miofibrille rispetto ai wt; l’osservazione non è stata riporodotta in cardiomiociti atriali ko per il gene. Questo suggerisce un ruolo di Pitx2 nel processo di maturazione cellulare selettivamente svolto nei ventricoli, dove potrebbe essere implicato nell’insorgenza delle alterazioni morfologiche riscontrate nei cuori cTP ko. In conclusione, l’espressione miocardica di Pitx2 agisce in modo differenziale nelle diverse regioni cardiache: nella regione senoatriale conferisce identità morfologica, molecolare e funzionale, mentre nei ventricoli modula il rimodellamento delle camere.