Suscettibilità ai patogeni di piante transgeniche per produzione di vaccini

Ottenere varietà più produttive e resistenti è sempre stato uno degli obiettivi principali del settore agrario. Nelle ultime decadi, lo sviluppo della tecnologia del DNA ricombinante, ha permesso di trasformare geneticamente le piante coltivate al fine di inserirvi caratteristiche nuove e specifiche, non conferibili con i metodi classici di miglioramento genetico. Grazie a queste tecniche, le piante possono essere utilizzate anche per produrre molecole o sostanze di interesse industriale, medico o chimico. L’utilizzo delle piante come bioreattori ha infatti avuto notevole sviluppo negli ultimi anni, soprattutto in ambito farmaceutico, sia medico che veterinario. Nell’ottica di utilizzare queste piante in coltura è necessario valutare oltre ai parametri produttivi, e in particolare la resa e la concentrazione della molecola di interesse nei tessuti della pianta, anche la loro risposta agli stress biotici e abiotici. Lo scopo di questo progetto di dottorato è stato quello di valutare la suscettibilità ai patogeni della pianta modello Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia, geneticamente trasformata con un gene esogeno di interesse farmaceutico, il gene HA del virus influenzale aviario H5N1, codificante una emoagglutinina. La trasformazione è stata effettuata mediante Agrobacteruim tumefaciens, introducendo in modo stabile il gene esogeno nel genoma della pianta, tramite il Gateway System della ditta Invitrogen utilizzando un sistema binario di vettori plasmidici in cui il trasferimento del frammento avviene per ricombinazione sito-specifica. Con il vettore di espressione così ottenuto si è trasformato Agrobacterium tumefaciens, con il quale è stata effettuata l’infezione dei boccioli fiorali tramite la procedura del Floral dipping. La successiva selezione dei semi trasformati ha consentito di individuare alcune linee transgeniche esprimenti in modo costitutivo, la proteina HA. L’inserimento nelle linee selezionate del costrutto genico è stata evidenziata tramite analisi PCR, utilizzando una coppia di primer specifici, mentre la presenza della proteina è stata verificata tramite analisi SDS-PAGE e Western Blot, utilizzando un anticorpo policlonale. Una ulteriore analisi per valutare il livello di espressione della proteina HA è stata effettuata mediante analisi Real Time. Le piante non mostravano alcuna apparente alterazione della crescita e dello sviluppo. Due linee trasformate esprimenti la proteina esogena in maggior quantità sono state infettate sperimentalmente con due patogeni vegetali, il virus Turnip Vein-Clearing Virus (TVCV) e il fungo necrotrofo Botrytis cinerea, entrambi in grado di infettare A. thaliana. Per determinare il livello di suscettibilità al virus delle linee transgeniche è stata valutata la propagazione dell’infezione a livello locale e sistemico. Per stabilire la suscettibilità a B.cinerea sono state considerate le diminuzioni delle lesioni e il grado di espressione di alcuni geni marker coinvolti nei processi di difesa della pianta (gene PDF1.2, patway del jasmonato e PR1, patway del salicilato). Nelle infezioni con il TVCV è stata osservata una maggiore presenza di virus nella linea trasformata rispetto alla linea WT sia a carico delle foglie della rosetta che di quelle apicali. Questa differenza inizialmente (3°- 4° DPI, Days Post Infection) è più evidente a livello delle foglie basali, mentre successivamente in corrispondenza del 5° e 6° DPI diventa molto più marcata nelle foglie apicali. Complessivamente la linea WT evidenzia che l’infezione virale è più rapida nelle foglie del caule che in quelle della rosetta, mentre la linea trasformata mostra un decorso inverso, più rapido nelle foglie della rosetta che in quelle apicali. Nel caso dell’infezione con B. cinerea le linee transgeniche mostrano una maggiore suscettibilità all’attacco del patogeno i quanto la media delle lesioni fogliari è stata circa tre volte maggiore di quella riscontrata nella linea WT, nonché un decorso dell’infezione più veloce. L’analisi dell’espressione di due geni coinvolti nella resistenza, ha confermato precedenti evidenze sulla base delle quali il pathway dipendente da jasmonato è maggiormente coinvolto nelle infezioni di funghi necrotrofi (Thomma et al. 1998). Le piante transgeniche sembrano quindi mostrare una maggior suscettibilità all’infezione con questi patogeni, forse giustificato dallo stress metabolico necessario per la produzione di grandi quantità di proteina esogena, che sottrae risorse per altre attività quali quelle connesse ai processi difensivi.