Novel formulations for Amphotericin B Delivery

SOMMARIO NUOVE FORMULAZIONI PER LA VEICOLAZIONE DI AMFOTERICINA B INTRODUZIONE L’amphotericina B (AmB) è un antibiotico macrolide con un ampio spettro d’azione, da oltre 40 anni usato nel trattamento di infezioni micotiche sistemiche. Sebbene recentemente siano stati sviluppati nuovi farmaci antifungni, AmB rimane il farmaco di prima scelta nel trattamento di gravi infezioni fungine e nel trattamento di leismaniasi viscerale nel caso in cui i parassiti sviluppino una resistenza ai composti antimoniali. La bassa solubilità di AmB è il principale problema al suo sviluppo farmaceutico e ad oggi si sono fatti numerosi tentativi per sviluppare formulazioni di AmB con migliorate caratterisitiche biofarmaceutiche e profilo terapeutico. Tra le principali formulazioni vi sono nanoparticlelle lipidiche solide, nanoparticelle polimeriche, micelle e bioconiugati polimerici La nefrotossicità è uno dei maggiori problemi all’uso clinico di questo farmaco che si unisce alla difficoltà della somministrazione intravenosa. Lo sviluppo di formualzioni per uso orale, intravenoso e topico con ridotta tossicità consente l’impiego di AmB nel trattamento di infezioni fungine sistemiche e topiche nel caso di infezioni miste resistenti oltre che nei tratatmenti tradizionali. Pertanto formulazioni innovative consentono un uso più razionale, sicuro e ampio di questo farmaco con una migliore performance terapeutica e compliance del paziente. OBIETTIVI La crescente importanza delle ripercussioni cliniche delle infezioni nell’uomo e nell’animale ha portato alla necessità di sviluppare formulazioni che possano essere sempre più efficacy nel trattamento di quetse patologie e in grado di coprire in modo ampio lo sviluppo di infesioni. L’ampio spettro di azione di amfotericina B (AmB) unitamente alla bassa resitenza sviluppata, rendono questo farmaco un eccellente candidato per il trattamento di vari tipi di micosi. Pertanto, il principale obiettivo di questo lavoro di tesi è stato lo sviluppo di nuove formulazioni di AmB per il tratatmento topico e sistemico di micosi con ridotta tossicità. Sono state sviluppate due tipi di formulazioni. Nella prima parte del lavoro di tesi lo studio si è focalizzato su formulazioni per uso topico. In particolare, si è sviluppato uno smalto per unghie contenente AmB per il tratatmento di onicomicosi miste resistenti ai tarttamenti tradizionali. Nella seconda parte del lavoro di tesi sono stati condotti studi formulativi di AmB in collaborazione con l’Università degli Studi di Padova. In quetso caso si è sviluppata una formualzione di AmB fisicamente PEGilata per il trattamento sistemico di infezioni fungine dopo somministarzione orale o intravenosa. In questo caso si è considerato che AmB è nota interagire con molecole di colesterolo e in generale stereoidee che ne favorisono la sua solubilità. Pertanto, si sono prodotti bioconiugati di moelcole steroidee con PEG in grado di aumentare la solubilità e stabilità di AmB. Si sono quindi preparati bioconiugati PEG-cholane e si sono ottenuti diversi tipi di assemblati AmB/PEG-cholane che sono stati caratterizzati attarverso varie tecniche tra cui: DLS, HPLC, DSC, RX, FTIR, CD, ITC e analisi con sicrotrone. Negli studi ex vivo di questi complessi si è studiata la tossicità mediante test di emolisi e l’efficacia antifungina contro Candida albicans. Infine, sono stati condotti alcuni studi in vivo dopo somministrazione orale e intarvenosa a topi. Le proprietà farmacocinetiche delle formualzioni di AmB sono state esaminate comapartvamente rispetto al farmaco in soluzione libera e a prodotti commerciali quali Ambisome® and Fungizone®. RESULTATI Per quanto riguarda le formulazioni di AmB per uso topico, sono state preparate diverse formulazioni di smalto per le unghie sia permeabili che impermabili. Per queste preparazioni sono stati studiati il tempo sdi essiccamento, la visocsità, l’spetto del film, la stesura in film, la brillantezza, il pH e la capacià di incorporamento di AmB. Tra i vari prototipi formulativi preprati, ne sono stati slezionati tre che sono stati oggetto di ulteriori studi in vitro (F11, F13 and F19). Sebbene le formulazioni 11, 13 e 19 consentissero di superare i problemi di bassa solubilità di AmB, la stabilità nel breve periodo (1 mese) ha rappresentato ancora un grande limite al loro impiego. La strategia impiegata per superare i problemi d stabilità di AmB ha portato a considerare in particolare lo sviluppo di polveri da ricostituire estemporaneamente. Le tecniche di freeze drying (nel caso di F11 e F13) e spray drying (nel caso di F19) hanno generato prodotti essiccati e liofilizzati stabili e facilmente risispersibili. Studi di penettrazione unghieale in vitro condotti su unghie femminili umane, hanno dimostrato una maggiore penetrazione nel caso di F19 (EF=1.95) rispetto a F11, F13 e al controllo. Gli studi in vitro condotti con Candida albicans ha dimostrato che la formualzione più efficace era F19 (103%). Lo smalto per unghie contenente AmB è risultato efficace nel tratatmento di infzsione dermatofitiche e non-dermatofitiche non localizzate nelle strutture cheratinizzate. Il trattamento per 30 giorni con F19, somministarto una volta al giorno a giorni alternati, ha portato all’eliminazione dell’infezione di T. mentagrophytes, T. rubrum, A. niger, F.oxysporum and F.solani. Dopo 30 giorni di trattamento non si è rilevato alcun microorganizmo né per esame diretto né con studi con culture cellulari. Per quanto riguarda le formulazioni PEGilate di AmB, gli studi di solubilità hanno dimostrato che il PEG5kDa-cholane può aumentare fino a 105 volte la solubilità di AmB con una correlazione lineare [farmaco sciolto]/[polimero]. La diversa capacità del PEG5kDa-cholane di solubilizzare AmB è stata ascritta alle diverse forme fisiche, monmeriche, multimeriche e aggregate del farmaco. Mediante calorimetria isotermica (ITC) è stata osservata una elevata affinità di AmB per PEG5kDa-cholane. Questa tecnica ha evidenziato la complessità delle inetrazioni tra il farmaco e il polimero che avvengono con diverse forme di AmB, monomeri e multimeri, inclusi nanoaggergati solubili la cui composizione e abbndanza dipende dal pH. I tre diversi siti di binding calcolati mediante ITC risultano ragionevolemente dalle interazioni di varie zone idrofobiche eptaeniche di AmB con la frazione dell’acido colanico. Il processo di liofilizzazione ha prodotto una polvere soffice con basso contenuto di umidità senza formazione di un cake. Questo prodotto è risultato stabile nel lungo periodo. L’analisi spettoemtrica CD ha mostrato che come nel caso di Fungizone® e Fungizone® riscaldato, le micelle di AmB/PEG5kDa-cholane non inuucono alterazioni struttirali di albumina (HSA). Gli studi di emolisi hanno confermato che le micelle di AmB/PEG5kDa-cholane sono meno emolitiche di Fungizone®. Anche nel caso in cui Fungizone® induce il 100% di emolisi, la formulazione AmB/PEG-cholane non provoca più del 30% di emolisi. Gli studi di attività biologica hanno mostrato che AmB formulate con PEG5kDa-cholane mantiene una elevata attività antifungina, che è risultata essere molto simile a quella di AmB in soluzione libera. La somministarzione orale di 5 mg/kg di AmB ha mostrato una maggiore emivita plasmatica del farmaco rispetto ad alter formulazioni. Infine, la somministarzione intravenosa di 1 mg/kg di AmB in Ambisome®, Fungizone® e AmB/PEG5kDa-cholane ha mostrato che la nuova formulazione ha una significativamente (P<0.01) minore costante di eliminazione apparente e una maggiore emivita plasmatica rispetto alle formualzioni commerciali Ambisome® and Fungizone®. CONCLUSIONI In questo lavoro di tesi vengono riportate le preparazioni di due tipi di formulazioni di AmB, una per uso topico per il trattamento di infezioni fungine unghieali (conclusione 1-3) e una formulazione per la somministrazione intarvenosa o orale per il trattamento di infesioni sistemiche (conclusione 4-12). Conclusioni: 1.- Un nuovo smalto per unghie impermeabile conetenente AmB è stato prodotto per il trattamento di onicomicosi. Il polimero (Eudragit L100®) e AmB non hanno dimostarto incompatibilità con il solvente (N-methyl-2-pyrrolidone). Una volta applicato sulla superficie lo smalto forma uno strato omogeneo, continuo, liscio e resistente all’acqua. 2.- Studi in vitro hanno dimostrato che lo smalto può penetrare le unghie con un incremento di quasi 2 volte rispetto al controllo. Studi di attività in vitro hanno dimostarto l’efficacia dello smalto per unghie nel trattamento di dermatofiti e non dermatofiti quali muffe (tipo Candida). 3.- Gli studi di efficacia in vivo condotti su cheratina di origine animale hanno dimostrato l’efficacia di AmB. Dopo un tratatmento di 30 giorni a giorni alternati, lo smalto per unghie ha eliminato le infezioni da Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum, Aspergillus niger, Fusarium. oxysporum e Fusarium solani. 4.- E’ stata sviluppata una nuova formualzione di AmB usando micelle costituite da un bioconiugato di 5 kDa monometossi polietilene glicole funzioanlizzato ad un terminale con acido colanico (PEG5kDa-cholane). Il polimero aumenta la solubilità di AmB di 105 volte con un rapporto molare 12:1 AmB/PEG5kDa-cholane (2:1 rapporto ponderale). 5.- Il sistema AmB/PEG5kDa-cholane forma micelle di 30 nm con le frazioni iderofobiche localizzate nella parte interna delle vescicole. L’anali del potenziale zeta a vari pH (5.5-7.2) ha dimostrato che in superficie le micelle sono quasi neutre. Il PEG5kDa-cholane interagisce con AmB attarverso tre siti di binding a seconda del pH suggerendo che l’interazione con il polimero dipende dallo stato di ionizzazione e aggergazione di AmB. 6.- Dopo liofilizzaizone, il prodotto può essere estempraneamnete risdisperso per formare una dispersione omogenea colloidale. La dispersione è risultata stabile da un punto di vista fisicochimico. Studi condotti con FTIR, DSC and XRD hanno dimostrato che nel prodotto liofilizzato, AmB e PEG5kDa-cholane interagiscono intimamente. 7.- Il rilascio di AmB dale micelle di PEG5kDa-cholane è riusltato avvenire con un profilo bifasico. Il best fitting dei profili di rilascio è stato ottenuto con il modello di Higuchi e Korsmeyer-Peppas. 8.- La tossicità della nuova formualzione è stata testata in termini di emolisi. La nuova formulazione AmB/PEG5kDa-cholane è sempre risultata meno emolitica rispetto al riferimento Fungizone®. 9.- L’attività antifungina di AmB testate contro Candida albicans ha mostrato che AmB/PEG5kDa-cholane è 15% più attiva del farmaco in tampone. 10.- I profili farmacocinetici ottenuti per somministarzione intarvenosa condotti con Ambisome®, Fungizone® e AmB/PEG5kDa-cholane sono risultati significativamente diversi. La costante di eliminazione apparente (Ke) della nuova formulazione è signficativamente (P<0.01) più bassa di quella ottenuta con Ambisome® e Fungizone®. Pertanto, il valore di emivita della nuova formulazione è risultata maggiore. Nei topi la somministarzione intravenosa di 1 mg/kg AmB/PEG5kDa-cholane ha causto una minore sofferenza rispetto alla stessa dose di Fungizone® e Ambisome®. 11.- Gli studi farmacocinetici condotti per somministarzione orale hanno dimostrato che questa formualzione consente di ottenere una maggiore emivita rispetto ad Ambisome® e Fungizone®. L’ AUC0-24 era simile in tutte le formualzioni testate. 12.- Si può quindi concludere che òa nuova formulazione AmB/PEG5kDa-cholane è un sistema di veicolazione promettente in quanto stabile, con minore tossicità rispetto a AmB libera e rispetto al prodotto commericale Fungizone®.