Biophysical analysis of the modulation of CLC-K channels by extracellular ligands

Le proteine CLC sono una famiglia di trasportatori del cloruro voltaggio dipendenti, omodimerici comprendenti sia canali del cloruro (ClC-0, ClC-1, ClC-2, ClC-Ka, ClC-Kb) che Cl-/H+scambiatori (da ClC-3 a ClC-7) (Accardi & Miller, 2004; Picollo & Pusch, 2005; Scheel et al, 2005). Essi sono implicati in importanti processi fisiologici come il trasporto epiteliale, l’eccitabilità di membrana, la regolazione del volume cellulare e l’acidificazione del lume del sistema endosomale-lisosomiale (Zifarelli & Pusch, 2007). Le proteine CLC sono espresse in tutti i phyla, in particolare nell’uomo ci sono nove geni che codificano proteine CLC. Il ruolo di queste proteine è messo in luce dalle malattie associate con mutazioni in corrispondenza dei geni codificanti proteine CLC (miotonia, malattia di Dent, sindrome di Bartter, osteopetrosi) (Zifarelli & Pusch, 2007; Jentsch, 2008). I canali del cloruro ClC-Ka e ClC-Kb, come i loro ortologhi murini ClC-K1 e ClC-K2, sono espressi nel rene e nell’orecchio interno dove essi sono rispettivamente coinvolti nel riassorbimento di NaCl (Kieferle et al, 1994) e nella produzione di endolinfa (Estévez et al, 2001). I canali CLC-K sono associati con una piccola subunità β chiamata barttin (Birkenhäger et al, 2001; Estévez et al, 2001). Mutazioni in ClC-Kb e barttin determinano la sindrome di Bartter, una malattia caratterizzata da perdita di sali ed ipokalemia (Simon et al, 1997; Birkenhäger et al, 2001). A causa della loro importante funzione fisiologica, i canali CLC-K rappresentano un potenziale bersaglio farmacologico. Tra i molti composti chimici che modulano i CLC-K, l’acido niflumico, un noto inibitore dei canali del cloruro, destava il nostro interesse a causa del suo inaspettato effetto sui CLC-K. NFA blocca ClC-K1(Liantonio et al, 2004; Picollo et al, 2007), ma sorprendentemente esso attiva le correnti di CLC-Kb e modula in modo bifasico CLC-Ka (Liantonio et al, 2006). Per identificare i residui aminoacidici responsabili dell’effetto attivatorio di NFA su ClC-Ka, noi eseguivamo una estensiva mutagenesi sito specifica di ClC-Ka e misure di voltage clamp dei mutanti espressi in oociti di Xenopus. Il risultato di questo lavoro era l’identificazione di tre residui (L155, G345, and A349) che sono coinvolti nel potenziamento attraverso NFA (Zifarelli et al, 2010). Calcio extracellulare e protoni modulano i canali CLC-K in un intervallo di concentrazione fisiologica. In particolare i canali sono attivati da aumento di calcio extracellulare e bloccati da pH acido extracellulare (Gradogna et al, 2010). Poichè il rene ha un ruolo importante nel riassorbimento di calcio e nel mantenimento dell’equilibrio acido-base (Frick & Bushinsky, 2003; Jeck et al, 2005), la regolazione da parte del calcio e dei protoni dei canali CLC-K è potenzialmente di rilevanza fisiologica. Noi eseguivamo una dettagliata analisi biofisica della modulazione da parte del Ca2+ e dei protoni dei canali CLC-K dell’uomo espressi in oociti di Xenopus. I dati sperimentali mostravano che sia Ca2+ che protoni modulano CLC-Ka in modo allosterico. Studi di modellistica indicavano un meccanismo a due stati (bloccato/non bloccato) per la modulazione dei protoni, mentre un modello comprendente quattro stati poteva descrivere in modo appropriato la modulazione da parte del calcio. Una estensiva analisi mutagenica combinata con misure di voltage clamp ci consentiva di identificare due mutazioni E261Q e D278N che riducevano la sensibilità al calcio di ClC-Ka. La vicinanza dei residui E261 e D278 appartenenti a differenti subunità suggeriva che probabilmente essi formano un sito di legame per il calcio intersubunità. Infatti il doppio mutante E261Q/D278N era completamente insensibile al calcio. Inoltre noi identificavamo una istidina, H497 responsabile per il blocco dei canali CLC-K causato dal pH acido (Gradogna & Pusch, 2010). Quindi decidevamo di studiare l’effetto del calcio sugli altri CLC-K. ClC-Kb presenta un comportamento simile a ClC-Ka, mentre ClC-K1 è più sensibile al calcio dei canali CLC-K dell’uomo. L’alta identità di sequenza e il fatto che la sensibilità al calcio è conservata tra i CLC-K suggeriva che il sito di legame per il calcio è una caratteristica condivisa da tutti i CLC-K. Il doppio mutante E261Q/D278N di ClC-Kb e ClC-K1 perdevano completamente la sensibilità al calcio confermando questa ipotesi. Per determinare la specificità del sito di legame del Ca2+ studiavo l’effetto di vari cationi divalenti (Zn2+, Mg2+, Ba2+, Sr2+, Mn2+) su ClC-Ka, ClC-K1e ClC-Kb. Sia ClC-Ka WT che il doppio mutante E261Q/D278N erano bloccati da 5 mM Zn2+ suggerendo che lo ione Zn2+ ha effetto sul canale interagendo con un sito di legame distinto. Lo ione Mg2+ non attivava i canali CLC-K a concentrazioni fino a 50 mM. Invece ClC-Ka e ClC-Kb erano attivati da Ba2+, Sr2+e Mn2+ con un ordine di potenziamento: Ca2+>Ba2+>Sr2+. E’ interessante osservare che ClC-K1 presentava un ordine di potenziamento modificato: Ca2+> Sr2+>> Ba2+. Inoltre il doppio mutante E261Q/D278N, insensibile al Ca2+, era anche insensibile al Ba2+ and Sr2+ (Gradogna et al, 2010; Gradogna & Pusch, 2010) dimostrando la specificità del meccanismo di attivazione dei canali CLC-K attraverso lo ione calcio e gli altri cationi divalenti. Infine, in collaborazione con il gruppo della Prof. Ildikò Szabò dell’Università di Padova, noi provavamo l’espressione funzionale del canale putativo sll0993 del cianobatterio Synechocystis sp. PCC6803 (Kaneko et al, 1996). La sequenza codificante della proteina e quella della proteina con EGFP al C-terminale erano inserite in vettori ottimizzati per l’espressione in oociti di Xenopus e testati per quanto riguarda l’espressione funzionale. Oociti iniettati con la proteina fusa con EGFP presentavano un consistente livello di fluorescenza dimostrando che la proteina era prodotta. Sfortunatamente, per nessuno dei due costrutti, con la tecnica del voltage clamp, potevamo rilevare correnti superiori rispetto a quelle viste in oociti non iniettati. Riassumendo, noi abbiamo effettuato una dettagliata caratterizzazione biofisica e molecolare dei meccanismi di regolazione dei canali del cloruro CLC-K attraverso ligandi extracellulari. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti presso l’Istituto di Biofisica del Consiglio Nazionale delle Ricerche a Genova (Italia) nel gruppo del Dott. Michael Pusch