Determinazione di marcatori di fosfolipidosi e di cardiotossicità

Lo scopo principale di questo progetto prevede la determinazione di marcatori di due patologie: cardiotossicità  e fosfolipidosi. Sono stati quindi pianificati ed effettuati studi di tossicologia, somministrando un composto cardiotossico (Isoproterenolo) e un composto fosfolipidogenico (Amiodarone) su ratti maschi di 9 settimane di età . Per l'Isoproterenolo sono stati condotti due studi: 1. una "dose selection" in cui sono state utilizzate tre diverse concentrazioni (2, 1, 0.3 mg/Kg). Al termine di questo studio, tutti i dati raccolti (tra cui peso del cuore, valori di Troponina I cardiaca e severità  delle lesioni a carico del miocardio) sono stati analizzati al fine di determinare la dose da utilizzare nel secondo studio. 2. "definitive study", alla dose di 0.3 mg/Kg. La somministrazione di Amiodarone, invece, è avvenuta a un unico dosaggio (300 mg/Kg). A fine di ogni studio, infatti, si è proceduto alla diagnosi e conferma delle patologie attese. L'istopatologia ha evidenziato lesioni dei miocardiociti dovute alla somministrazione dell'Isoproterenolo. La lesione è stata confermata anche grazie all'analisi in chemiluminescenza della Troponina I Cardiaca (indicatore di necrosi) e di un pannello di altri biomarcatori di lesione a carico del miocardio (Troponina I e T cardiaca, Fatty Acid Binding Protein 3 e Myosin light chain 3) tramite un ELISA multi-spot. La valutazione dell'accumulo di fosfolipidi dopo la somministrazione di Amiodarone è avvenuta mediante blood smear e microscopia elettronica. Una prima analisi mediante microscopia ottica sullo striscio di sangue ha permesso di evidenziare l'accumulo di vacuoli all'interno del citoplasma dei linfociti periferici. L'analisi ultrastrutturale mediante microscopia elettronica ha permesso di confermare l'accumulo di fosfolipidi nelle cellule del sangue e di evidenziarne la formazione anche a livello del tessuto cardiaco. Il Microarray è stato effettuato solamente sul cuore per quanto riguarda lo studio Isoproterenolo, su cuore e sangue per lo studio Amiodarone. Il programma SAM (Statistical Analysis of Microarray) è stato utilizzato per effettuare l'analisi statistica, al fine di identificare i geni modulati dal trattamento con le due molecole. Ogni normalizzazione dei controlli è stata analizzata con la rispettiva normalizzazione dei trattati. Si è proceduto poi a estrapolare quei geni che fossero significativamente modulati per tutte le quattro normalizzazioni. L'analisi statistica effettuata ha permesso di identificare: per l'Isoproterenolo (cuore) un'induzione di 14 geni e un'inibizione di 62 geni, con un FDR (false DiscoveryRange) del 9%; per l'Amiodarone, nel cuore un'induzione di circa 231 geni e un'inibizione di 314 geni, con un FDR del 1%; nel sangue, un up-regulation di circa 2718 geni e un'inibizione di 5500 geni con un FDR sempre del 1%. Per l''identificazione di un pannello di geni come markers della fosfolipidosi sono stati seguiti i seguenti criteri di selezione: geni possibilmente coinvolti nell'induzione della fosfolipidosi, fold change, letteratura e analisi mediante cluster. A tal fine, sono stati inoltre messi a confronto i geni modulati nel cuore e nel sangue dopo la somministrazione dell'Amiodarone e si è osservato che 41 geni tra gli indotti e 69 tra gli inibiti venivano modulati in entrambe le matrici. L'interpretazione di queste valutazioni ha permesso di identificare un primo pannello di marcatori della fosfolipidosi comprendente i seguenti geni: Pla2g2a, Pla2g7, Gal, Il1b, Cebpb, Fcgr2b and Acer2. Per confermare i dati di microarray, i livelli di espressione genica dei geni selezionati sono stati misurati in Real-Time PCR sugli stessi campioni (l'analisi per ogni campione è stata eseguita in triplice copia). Media e deviazione standard intra-campione e intra-gruppo sono state calcolate per confermare una buona correlazione dei nostri dati. E' stata effettuata inoltre l'analisi T-test dei valori di RQ del gruppo di controllo e del gruppo di trattamento per i 7 geni del pannello. Un P <0,01 è stato determinato per tutte le analisi T-test di dati quantificati in Real-Time. Solo IL1B nel tessuto cardiaco ha mostrato un P <0,05. Tutti i valori ottenuti sono stati infine identificati come inliers. Infatti, al fine di escludere i dati anomali, è stato utilizzato il Grubb test. L'analisi di espressione genica mediante microarray, sui campioni trattati con Isoproterenolo, ha permesso di identificare la modulazione di 78 geni. Tali geni appartengono prevalentemente a proteine strutturali e, quindi, più facilmente identificabili con saggi anticorpali su sequenze amminoacidiche del biomarcatore. Per il pannello dei marcatori molecolari di cardiotossicità , si è effettuata la validazione e l'analisi di microRNA in Real-Time PCR. La modulazione del miR-21 è stata valutata sui campioni di controllo e di trattati con Isoproterenolo. Il miR-21 è un microRNA responsabile della "sopravvivenza" dei Fibroblasti cardiaci in condizione di fibrosi, rimodellamento o disfunzioni cardiache. Le analisi effettuate hanno evidenziato un up-regulation di miR-21 dopo la somministrazione di Isoproterenolo, con un fold-change di circa 3 tra il gruppo dei controlli e il gruppo dei trattati. Il pannello di marcatori biologici è stato completato con l'analisi dellANP sul siero di ratti Han Wistar (controlli) e ratti SHR (ceppo con ipertensione) di 10 settimane e 24 settimane di età. Le analisi hanno messo in evidenza un aumento rispettivamente di 2.4 e 5.2 fold-change tra i due ceppi. E' stata inoltre misurata la cTnI degli stessi campioni e non si è osservata nessuna differenza tra il ceppo normoteso e il ceppo iperteso. L'ANP permette quindi di identificare disfunzioni cardiache, come cambiamenti pressori, in cui non si presenta necrosi a carico dei miocardiociti.