Genetic and proteomic approach to the urticating system of processionary moths (Thaumetopoeinae, Lepidoptera)

Riassunto Le larve delle processionarie europee e mediterranee (genere Thaumetopoea) producono delle setole urticanti dal terzo stadio larvale al quinto sulla parte dorsale dell’addome, in specifiche aree denominate “specchi”. Le setole sono facilmente removibili dal tegumento e sono importanti per la difesa dell’insetto nei confronti di vertebrati predatori. L’impatto delle setole urticanti sull’uomo è stato ripetutamente descritto e consiste prevalentemente nella manifestazione da contatto con la complicazione dell’insorgenza di risposte allergiche. Il meccanismo di azione è complesso e riguarda sia una lesione meccanica causata dalla penetrazione della setola sia il rilascio di proteine con potere antigenico. Risulta quindi importante esplorare i geni potenzialmente coinvolti nel meccanismo di difesa, al fine di identificare le proteine associate con le setole e chiarire la loro espressione durante lo sviluppo larvale. Inoltre, il genere comprende diverse specie e sembra opportuno esplorare la variabilità dei geni coinvolti a livello intra- e interspecifico. Nell’introduzione della tesi presento i diversi tipi di setole urticanti degli artropodi, focalizzandomi su quelle che vengono denominate “setole urticanti” caratteristiche delle processionarie, gli aspetti medici correlati, l’epidemiologia e i geni correlati alle proteine antigeniche. Uno dei principali obiettivi del mio lavoro è quello di caratterizzare tutte le proteine, urticanti e non, presenti all’interno delle setole e provare a identificare altre proteine antigeniche, oltre alla già nota Tha p 2. Altri obiettivi sono quelli di concentrarsi sul profilo di espressione della proteina Tha p 1 (una proteina isolata da larve di processionaria del pino e riconosciuta come antigene da persone esposte all’insetto, ma successivamente identificata come appartenente al gruppo delle proteine chemosensoriali) e Tha p 2 in tutti gli stadi vitali di Thaumetopoea pityocampa, e la caratterizzazione del gene Tha p 2 in tutte le specie del genere Thaumetopoea disponibili e anche in altre della sottofamiglia delle Thaumetopoeainae, per studiare l’evoluzione della proteina in questo gruppo. Nel primo studio ho provato due protocolli di estrazione proteica per creare un data set completo di tutte le proteine, sia urticanti che non, presenti nelle setole. Possibili proteine antigeniche sono state riconosciute utilizzando i sieri di persone precedentemente esposte e con reazioni acute. É stata ottenuta un’elevata quantità di proteine che ha permesso di confermare che le setole urticanti di Th. pityocampa contengono proteine, alcune delle quali sono riconosciute da Ig-E di persone precedentemente esposte a larve di questo insetto. Inoltre ho potuto ottenere informazioni riguardo la qualità e la quantità delle proteine associate alle setole. Nel secondo studio mi sono concentrata sull’espressione dei geni associati alle proteine urticanti Tha p 2 e Tha p 1 in tutti gli stadi larvali di due popolazioni italiane e per gli ultimi stadi e le uova di due popolazioni portoghesi. Ho potuto confermare l’espressione del gene Tha p 1 in tutti gli stadi di Th. pityocampa di tutte le popolazioni, mentre il gene Tha p 2 è espresso solo negli stadi larvali dove le setole sono prodotte (dal terzo al quinto). Nel terzo studio, ho sequenziato il gene Tha p 2 in tutte le specie della sottofamiglia Thaumetopoeinae disponibili, concentrandomi su membri del genere Thaumetopoea, così come su specie non affini, per capire le proprietà chimico-fisiche della proteina, la natura dei geni e la loro storia evolutiva. Questo studio ha permesso di identificare due diverse isoforme del gene Tha p 2 in tutte le specie, che può essere interpretato come un risultato di eterozigosi del singolo gene. L’unica eccezione è rappresentata da una specie (Thaumetopoea wilkinsoni) nella quale sono state individuate 20 diverse isoforme in un unico campione; ciò porta a pensare che possano esistere molteplici copie del gene. I capitoli supplementari includono due parti alle quali ho lavorato durante il periodo della tesi, per ottenere materiale utilizzabile durante gli altri esperimenti. La prima parte riguarda il confronto del tempo di sviluppo di quattro popolazioni di processionaria del pino mantenute in condizioni controllate di laboratorio. Le quattro popolazioni, caratterizzate da diversa fenologia, mantengono un ciclo vitale annuale anche in condizioni favorevoli a un rapido sviluppo larvale, soprattutto grazie alla flessibilità della durata dello stadio pupale. La seconda parte dell’appendice è una descrizione della biologia di Thaumetopoea herculeana campionata in Spagna e studiata per l’analisi del gene Tha p 2. Nel complesso, la tesi approfondisce la conoscenza del sistema urticante delle processionarie, puntando a individuare gli ulteriori passi necessari per chiarire il complesso meccanismo associato allo sviluppo di reazioni cutanee negli esseri umani e, possibilmente, in vertebrati predatori che sono il bersaglio naturale della setole. Inoltre, le analisi rivelano che il sistema urticante e i geni associati sono ben conservati nel gruppo e potrebbero essere un fattore importante nella storia evolutiva in questo e in altri gruppi di artropodi che condividono meccanismi di difesa simili.