Resistenza all'aspirina in pazienti affetti da Policitemia Vera e Trombocitemia Essenziale: caratteristiche biomolecolari e della funzionalità piastrinica.

INTRODUZIONE L’uso di aspirina a basse dosi (100mg/die) previene gli eventi trombotici migliorando del 22% la probabilità di sopravvivenza dei soggetti che hanno sofferto di problemi cardiovascolari. Tuttavia, si stima che circa un quarto dei soggetti in terapia vadano ugualmente incontro a manifestazioni tromboemboliche (resistenza all'aspirina). E’ descritta anche un resistenza farmacologica, quando cioè il farmaco non è in grado di inibire efficacemente l’aggregazione piastrinica e la produzione di trombossano. Le cause della resistenza non sono ancora ben chiare: sono state prese in considerazione la non-compliance dei pazienti, l'incompleto assorbimento del farmaco, la mancata inibizione di COX-1, le alterazioni genetiche della Glicoproteina IIIa (GPIIIa) (HPA-1). Anche i soggetti affetti da neoplasie mieloproliferative (MPN) sono a rischio di complicanze tromboemboliche e lo studio ECLAP ha dimostrato che 100 mg/die di aspirina sono efficaci anche in questi pazienti per la prevenzione di eventi cardiovascolari. La quasi totalità dei pazienti affetti da policitemia vera (PV) e circa la metà di quelli con trombocitemia essenziale (ET) sono portatori della mutazione puntiforme ed acquisita a carico del gene della Janus Kinasi 2 (JAK2); la mutazione sostituisce con una fenilalanina una valina di piccole dimensioni in posizione 617 dell’esone 14 (V617F). Tale mutazione sembra essere un fattore di rischio protrombotico per i pazienti affetti da MPN. SCOPO DELLO STUDIO L'obiettivo principale del nostro studio è stato determinare se effettivamente la resistenza clinica e/o farmacologia all'aspirina si verifichi anche nei pazienti affetti da MPN. Si è inoltre cercata una correlazione tra resistenza all’aspirina e alcune variazioni genetiche, in particolare la mutazione JAK2V617F e il polimorfismo HPA-1. Abbiamo valutato infine l’utilità dell’aggregazione piastrinica e del dosaggio del trombossano (TxB2) sierico per riconoscere la non-responsività all’aspirina in questi particolari pazienti. PAZIENTI E METODI Sono stati studiati 83 pazienti affetti da MPN in terapia con aspirina (100mg/die) (MPN in ASA), 40 pazienti con MPN alla diagnosi non ancora in trattamento (MPN basali), 50 pazienti in terapia con aspirina (100mg/die) (Controlli in ASA) e 42 soggetti sani (Controlli). E’ stata ricercata la mutazione JAK2 V617F mediante PCR allele-specifica. Il polimorfismo HPA-1 è stato ricercato con discriminazione allelica in real time PCR. La resistenza farmacologica è stata studiata con aggregazione indotta da acido arachidonico (AA) secondo metodo di Born e il dosaggio del trombossano B2 (TxB2) sierico con metodica ELISA. Le differenze nella distribuzione genotipica tra i diversi gruppi di pazienti sono state valutate mediante test del χ2 e test di Fisher. Si è utilizzata una curva ROC per determinare un valore di cut-off per i livelli di TxB2. Tutte le analisi statistiche sono state effettuate mediante il software GraphPad Prism5, considerando come soglia di significatività p<0.05. RISULTATI La mutazione JAK2V617F è stata trovata nel 90.1% dei pazienti affetti da PV e nel 75.6% dei casi con ET. L’incidenza della mutazione JAK2V617F negli MPN trattati e non trattati con aspirina non era statisticamente diversa. L’incidenza delle complicanze trombotiche non è statisticamente maggiore nei casi portatori di mutazione JAK2V617F (p=0.15). Dei 25 pazienti che hanno sofferto di complicanze trombotiche, 23 (92%) erano portatori della mutazione JAK2V617F mentre la mutazione era presente nel 71% dei casi senza complicanze trombotiche (p=0,0172). La frequenza dell’allele b di HPA-1 è stata comparabile negli MPN che hanno o non hanno sviluppato trombosi (p=0,46). Due degli 83 pazienti (2,4%) che erano in terapia con ASA hanno sofferto di eventi tromboembolici durante il trattamento. Tutti i Controlli in ASA (100%) mostravano una curva di aggregazione soppressa (< 10%), mentre 22 MPN in ASA (26,5%) avevano curve di aggregazioni non soppresse (80±16%). Né la presenza della mutazione JAK2V617F nè quella dell’allele b influenzano la risposta all’aspirina in base ai risultati dell’aggregazione (p=0.8 e p=0.42). Non è stata trovata alcuna differenza statistica nei livelli di TxB2 sierico tra i Controlli e gli MPN basali (p=0,75), né tra gli MPN in ASA e i Controlli in ASA. Gli MPN basali hanno livelli di TxB2 sierico significativamente maggiori di quelli in ASA (p=0,0414) e i Controlli significativamente superiori ai Controlli in ASA (p<0,0001). Normalizzando i valori in base al numero di piastrine, non è stata trovata differenza tra Controlli ed MPN basali (p=0,5), mentre erano significativamente più elevati i valori di TxB2 rilasciato dai Controlli rispetto ai Controlli in ASA (p=0,019). Analogamente, i livelli di TxB2 si riducono dopo trattamento con aspirina nei pazienti MPN (p<0,0001); tuttavia, gli MPN in ASA mostrano livelli significativamente più elevati rispetto ai Controlli in ASA (p<0,0001). Con la costruzione di una curva ROC, si è stabilito che il valore di TxB2 948 pg/plts x 10-8 rappresenta il cut-off per distinguere i pazienti in cui la terapia con ASA determina efficace soppressione dei valori di TxB2. Nessuno dei Controlli e degli MPN basali mostrava un valore di TxB2 inferiore a 948 pg/plts x 10-8, mentre tra i Controlli in ASA e gli MPN in ASA, 2 /21 (9,5%) e 37/77 (48%) rispettivamente, mostravano livelli maggiori del cut-off (resistenti). 18 MPN in ASA (25%) aggregavano normalmente e presentavano livelli di TxB2 elevato malgrado l’uso di aspirina (resistenti all'aspirina). I 2 casi che hanno sviluppato complicanze trombotiche durante la terapia con aspirina avevano livelli di TxB2 maggiori di 948, ma solo in uno di essi l’aggregazione era soppressa. CONCLUSIONI La mutazione JAK2V617F è risultata presente nella quasi totalità dei pazienti con eventi trombotici. La presenza dell’allele raro b di HPA-1 non sembra correlabile con le complicanze trombotiche dei pazienti con MPN. Non sembra esistere alcuna relazione tra la presenza di mutazione JAK2 o dell'allele b e la resistenza all’aspirina. La resistenza all’aspirina non è diversa nei pazienti affetti da MPN e nella popolazione generale. L’aggregazione piastrinica indotta da AA è risultata capace di identificare la resistenza all’aspirina in circa il 25% dei pazienti con MPN. Il cut-off capace di stabilire la mancata soppressione del TxB2 da parte dell’aspirina è di 948 pg/plts x 10-8. Un livello superiore a 948 pg/plts x 10-8 di TxB2 stabilisce la mancata inibizione della produzione di trombossano da parte dell’aspirina. Il dosaggio del TxB2 è risultato capace di identificare la resistenza all’aspirina in circa la metà dei pazienti con MPN. Non è stata riconosciuta alcuna relazione tra la resistenza clinica e la resistenza farmacologica.