Confined extracellular environment affects pluripotency maintenance and acquisition

Le cellule staminali pluripotenti umane sono sia una fonte illimitata di cellule d’interesse, sia un modello di embriogenesi. In vitro sono stati isolati due stadi di cellule staminali pluripotenti: naïve e primed. Inoltre, la pluripotenza può anche essere riacquisita da cellule differenziate, grazie alla riprogrammazione cellulare che riscrive il programma di espressione cellulare aprendo le porte alla medicina personalizzata. L’utilizzo di chip microfluidici per la riprogrammazione cellulare consente esperimenti ad alta efficienza e costi ridotti. Le ragioni per questa alta efficienza di riprogrammazione non sono pienamente noti. Il cancro può essere considerata un’alterazione patologica del programma di espressione cellulare, dove mutazioni geniche promuovono un de-differenziamento delle cellule con riacquisizione di proliferazione illimitata e motilità. La riprogrammazione cellulare può resettare lo stato epigenetico tumorale e ristabilire il corretto programma di espressione. I recenti studi si focalizzano principalmente sulle differenze di espressione genica fra cellule staminali naïve, primed, somatiche o riprogrammate, senza considerare l’ambiente extracellulare che circonda le cellule stesse, il contributo della matrice extracellulare e l’organizzazione spaziale tridimensionale di queste cellule; fattori fondamentali per lo sviluppo embrionale in vivo. Allo scopo di analizzare il contributo dell’ambiente confinato al mantenimento e all’acquisizione di pluripotenza, l’ambiente di coltura è stato miniaturizzato con chip microfluidici per simulare le condizioni in vivo. Bersagli molecolari specifici sono stati affiancati da approcci multi-omici come l’analisi del secretoma e del trascrittoma. Inoltre, l’eterogeneità del sistema è stata analizzata con tecniche single-cell. La struttura della matrice extracellulare di cellule staminali naïve e primed e di fibroblasti differenziati cresciuti in supporti convenzionali di crescita cellulare è stata analizzata, dimostrando una differente organizzazione della matrice extracellulare. In seguito è stata valutata l’influenza dell’ambiente confinato in piattaforme microfluidiche, rivelandone un ruolo nell’indurre produzione di matrice. Successivamente è stato esaminata in colonie naïve, la relazione tra forma 3D della colonia, meccanotrasduzione e deposizione di matrice, rivelando che a una maggior organizzazione 3D della colonia corrisponde a maggior produzione di matrice e di espressione di marcatori di pluripotenza naïve. Inoltre l’organizzazione della matrice extracellulare è stata analizzata alla fine del processo di riprogrammazione cellulare sia in supporti convenzionali sia in piattaforme microfluidiche, mostrando una deposizione molto dissimile nei due ambienti. Questa osservazione può contribuire a spiegare l’alta efficienza di riprogrammazione ottenuta in piattaforme microfluidiche. Per simulare la riprogrammazione di cellule tumorali con elevata espressione di SERPINB3 e studiare la possibile influenza di SERPINB3 su tale processo, la proteina è stata somministrata durante esperimenti di riprogrammazione di cellule modello, portando al crollo dell’efficienza di riprogrammazione. Per spiegare il risultato sono stati analizzati geni collegati a SERPINB3 in database trascrittomici. Questa tesi contribuisce ad accrescere le conoscenze sulle cellule staminali pluripotenti analizzando per la prima volta l’organizzazione della matrice extracellulare in cellule staminali pluripotenti naïve e primed. Inoltre mostra come la matrice extracellulare e l’organizzazione tridimensionale della colonia siano collegati all’espressione di geni di pluripotenza in cellule naïve e all’acquisizione di pluripotenza in caso di riprogrammazione cellulare. Infine riporta come SERPINB3 inibisce la riprogrammazione cellulare, suggerendo la possibilità di inibire questa serpina per affrontare la riprogrammazione di tumori con elevata espressione di SERPINB3.