Struttura fine della zona di transizione ciliare e localizzazione della proteina CEP290 durante la ciliogenesi nell'organismo modello Chlamydomonas reinhardtii

Ciglia e flagelli, i due termini sono intercambiabili, sono organelli cellulari altamente conservati nel corso della evoluzione delle cellule eucariotiche, dove svolgono ruoli quali la motilità cellulare, o la propulsione dei fluidi sulla superficie degli epiteli ciliati o la ricezione di stimoli meccanici e chimici dalla matrice extracellulare. Recentemente è stato anche dimostrato il loro coinvolgimento nella regolazione del ciclo cellulare. Difetti nei meccanismi di assemblaggio e mantenimento funzionale in ciglia e flagelli comportano l’insorgenza di patologie di varia gravità spesso caratterizzate da vere e proprie sindromi per le quali è stato coniato il termine ciliopatie. Il sostanziale aumento dell’incidenza delle ciliopatie insieme alla loro severità, hanno posto in evidenza la necessità di comprendere sempre più a fondo i meccanismi implicati nell’assemblaggio, mantenimento e funzionalità delle ciglia negli eucarioti compreso l’uomo. Sebbene infatti questi organelli siano stati oggetto di numerosi studi, c’è ancora molto da comprendere circa la loro morfologia funzionale. Molte evidenze indicano che i complessi proteici precursori del proteoma flagellare, vengono sintetizzati nel comparto citoplasmatico, ma devono essere poi trasportati o diffondere nel comparto flagellare per consentire l’accrescimento e il successivo mantenimento funzionale delle ciglia. E’ altresì noto che l’ammissione dei precursori destinati al comparto flagellare sia selettiva e che la selezione avvenga a livello del poro ciliare, anche conosciuto come Zona di Transizione (TZ) che si trova alla base di ciglia e flagelli. La TZ ha una struttura piuttosto conservata ed è altresì noto che gruppi di proteine organizzati in moduli costruttivi e funzionali quali ad esempio le Nefrocistine e le Meckeline, presenti a livelli diversi della TZ, siano coinvolti nella funzione di essa; sappiamo anche che mutazioni per queste proteine comportano disordini funzionali nelle ciglia che conducono a loro volta alla comparsa di varie ciliopatie nell’uomo e fenotipi alterati in vari organismi modello. Varie evidenze indicano che la proteina CEP290, conosciuta anche come nefrocistina-6 nelle ciglia umane, sia presente a livello della TZ e che sue delezioni siano in grado di compromettere il controllo dell’assemblaggio ciliare. Inoltre è dimostrato che la mutazione di questa proteina sia presente in alcune ciliopatie come la Amaurosi congenita di Leber, la sindrome di Meckel, e quella di Joubert. Recenti lavori realizzati mediante tecniche di immunofluoroscenza e immunoelettro microscopia indicano che CEP290 è localizzata a livello della TZ. Ma il suo ruolo specifico non è ancora conosciuto. Il lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio ultrastrutturale e la modellistica 3D della TZ in ceppi selvaggi e nel mutante per CEP290 dell’organismo modello Chlamydomonas reinhardtii. durante l’accrescimento flagellare dopo deflagellazione indotta tramite shock di pH. Sono state selezionate due popolazioni cellulari: una fissata all’inizio della rigenerazione e l’altra dopo 90 minuti dalla deflagellazione. I dati presentati in questa tesi, sono stati ottenuti impiegando tecniche avanzate di microscopia elettronica come la tomografia elettronica in doppio asse di tilt, su sezioni spesse di campioni inclusi in resina. Le analisi ed elaborazioni post imaging dei modelli 3D della TZ, hanno permesso di studiare la distribuzione spaziale delle componenti strutturali di questo particolare comparto. L’analisi comparativa tra cellule di ceppo selvaggio e mutante per la proteina CEP290 ha permesso di osservare la struttura fine della TZ all’inizio ed alla fine della rigenerazione. E’ stato così possibile identificare significativi cambiamenti nella estensione e nella organizzazione strutturale delle wedge shaped structures (WSS) che in C. reihardtii si dipartono dall’hub centrale della TZ ma si estendono alla membrana flagellare solo alla fine della maturazione flagellare. I nostri studi hanno consentito altresì di dimostrare l’assenza di questo cambiamento nelle WSS durante la rigenerazione flagellare del ceppo mutante CEP290 nel quale esse non raggiungono mai il contatto con la membrana flagellare lasciando libero lo spazio della TZ dove transitano i treni del trasporto intraflagellare. Era stato dimostrato in letteratura che CEP290, risultasse localizzata tramite immunomarcatura in post-embending a livello delle Y-link presenti nella TZ di C. reinhardtii e come queste strutture risultassero assenti nel mutante CEP290. Un nostro studio successivo aveva invece rivelano la presenza delle Y-link nello stesso ceppo. Abbiamo allora deciso di implementare i dati di localizzazione della proteina CEP290 ottimizzando la metodica del post-ebbending immuno labeling associata al Gold-Enhance, impiegando cellule wt a inizio e fine rigenerazione flagellare. I dati ottenuti hanno mostrato una localizzazione della proteina CEP290 nello spazio compreso tra Basal Body e TZ in associazione alla parete dei doppietti microtubulari rivolta verso il lume della TZ ed anche sulle transition fibers (TF) che ancorano il basal body alla membrana cellulare e fungono da filtro molecolare caratteristico del poro ciliare. Abbiamo quindi potuto stabilire con precisione di questa proteina nel gate ciliare. Questi dati ed i protocolli analitici messi a punto nei nostri laboratori, aprono nuove ed interessanti prospettive per studi di localizzazione ad alta risoluzione, anche in tomografia elettronica, di altre proteine presenti nei moduli organizzativi della TZ altresì in altri modelli cellulari con evidenti vantaggi nella comprensione della morfologia funzionale del poro ciliare.