CYP450 aromatasi e fosfodiesterasi 5 (PDE5) umane: verso la ricerca di nuove piattaforme per lo screening di inibitori

Capitolo 1: Caratterizzazione elettrochimica dell’enzima CYP450 aromatasi immobilizzato su elettrodo d’oro. Aromatasi è un citocromo P450 microsomiale, responsabile della conversione degli androgeni in estrogeni. La sintesi locale degli estrogeni da parte di aromatasi ha un ruolo importante nel promuovere la crescita di tumori al seno estrogeno-dipendenti. Ad oggi, tre sono gli inibitori di aromatasi approvati dalla FDA (anastrozolo, letrozolo e exemestano) in uso come trattamento di prima-linea in pazienti con tumore al seno ormone-dipendente o per tumori over-esprimenti tale enzima. Tuttavia, dato l’incremento del numero di pazienti resistenti alle terapie standard, è di continuo interesse l’identificazione di suoi nuovi inibitori. Come membro della famiglia dei CYP450, aromatasi presenta un centro catalitico costituito da un gruppo eme, a cui la citocromo P450 reduttasi fornisce gli elettroni necessari alla reazione. Nonostante i progressi compiuti nella determinazione delle relazioni tra la struttura e la funzione di aromatasi, non è ancora stato descritto il comportamento dell’enzima immobilizzato su elettrodo. Scopo del lavoro di tesi è, dunque, la caratterizzazione elettrochimica dell’enzima aromatasi, nativo e in associazione con il suo substrato (androstenedione) e con il suo inibitore (anastrozolo), in seguito ad immobilizzazione su elettrodo d’oro funzionalizzato con un SAM di 100% MUA e di 50:50 MUA-MU. In questo modo, è l’elettrodo a svolgere la funzione di donatore-accettore di elettroni, consentendo di studiare il processo di trasferimento elettronico tramite esperimenti di voltammetria ciclica (CV). Lo stato conformazionale dell’enzima, la struttura del sito attivo e il legame substrato/inibitore, durante l’immobilizzazione, sono stati monitorati attraverso esperimenti di SERRS. Data l’importanza di aromatasi per la salute e l’interesse nell’identificazione di suoi nuovi inibitori, una sua caratterizzazione su elettrodo è centrale nella realizzazione di una piattaforma elettrochimica per lo screening high-throughput di nuovi candidati farmaci. Capitolo 2: PDE5 umana: realizzazione di un sistema-modello basato sulla FRET. La fosfodiesterasi 5 (PDE5) è l’enzima responsabile dell’idrolisi del cGMP a 5’-GMP. Il cGMP è un messaggero cellulare secondario con un importante ruolo in diversi processi fisio-patologici. Recentemente, diversi gruppi hanno riportato un aumento dell’espressione della PDE5 in diversi tumori quali colon, polmone, seno e melanoma. Quattro sono gli inibitori della PDE5 approvati dalla FDA (sildenafil, tadalafil, verdenafil, avalafil) prescritti come trattamento di diversi disordini e di recente è emerso un loro possibile uso anche nel meccanismo di sensibilizzazione delle cellule tumorali al trattamento chemioterapico. Data l’emergente importanza della PDE5 in diversi ambiti, numerosi sono gli studi per l’identificazione di nuovi composti in grado di inibirne l’attività. Attualmente vi sono pochi saggi disponibili in commercio per lo screening di ligandi/inibitori della PDE5, tutti basati sull’analisi indiretta di tale legame. In questo lavoro di tesi è stato ideato un nuovo sistema modello per monitorare in maniera diretta il legame di inibitori al sito catalitico della PDE5. Tale modello prevede l’utilizzo della metodica di FRET, che permette di studiare interazioni intra- o intermolecolari a distanza ravvicinata (1-10 nm). Per fare ciò, è stato espresso il dominio catalitico della PDE5 ingegnerizzato in modo da poter essere coniugato al fluoroforo arseniato FlAsH. E’ stato inoltre ideato e sintetizzato un analogo strutturale del substrato coniugato a un fluoroforo accettore di FRET. Il sistema così progettato consentirebbe di compiere screening high-troughput di nuovi possibili inibitori.