ATTIVITÀ ANTIPROLIFERATIVA DI NUOVI DERIVATI DI SINTESI A STRUTTURA 2,3-BENZODIAZEPINICA SU DIVERSE LINEE CELLULARI TUMORALI

Lo sviluppo di terapie mirate per il trattamento di tumori maligni è aumentato notevolmente negli ultimi anni. Questo progresso ha consentito di ridurre al minimo gli effetti collaterali e, in alcuni casi, il numero di morti. Tuttavia, nonostante questi progressi, il cancro è ancora la prima causa di morte nei paesi occidentali. In questa prospettiva, molte molecole sono state sintetizzate al fine di sfruttare le loro caratteristiche per regolare specifiche pathways coinvolte nella proliferazione cellulare. IL GYKI 52466 è una 2,3-benzodiazepina che agisce selettivamente su un recettore AMPA come antagonista allosterico non-competitivo. È noto per avere proprietà anticonvulsivanti e neuroprotective. Alcuni studi hanno riferito gli effetti anti-proliferativi del GYKI 52466 su diverse linee cellulari tumorali, inibendo la extracellular signal regulated kinase (ERK1/2). L'obiettivo del presente progetto di tesi è quello di indagare l'effetto citotossico di un nuovo derivato 2,3-benzodiazepinico, un AMPA antagonistà non competitivo, chiamato composto 1g, su diverse linee cellulari tumorali al fine di identificare una possibile nuova molecola per la terapia del cancro. In particolare in questo progetto di tesi di dottorato, abbiamo testato il composto 1g su un pannello di 16 linee cellulari, considerando la varietà fenotipica di ogni linea cellulare (PLC/PRF/5, U-87MG, HEP-G2, HT-29, KG-1, Kasumi, HL60, NB4, Jurkat T cells, U937, HCT116, SH-SY5Y, granulles cells, DRG, NIH-3T3, linfociti T periferici). Inoltre abbiamo esplorato il meccanismo di morte cellulare e la capacità di questo composto ad arrestare il ciclo cellulare in cellule leucemiche jurkat T cells. RISULTATI: Il composto 1g ha mostrato una importante attività citotossica e antiproliferativa nelle 16 linee cellulari tumorali umane testate con un valore di GI50 variabile da 1,5 a 50 µM, mentre sulle cellule wild type (granulles cells, DRG, NIH-3T3, linfociti T periferici), il composto ha esibito una bassa citotossicità. È stata esplorata la distribuzione del ciclo cellulare nelle jurkat mediante analisi di incorporazione della BrdU. L'aumento della percentuale delle cellule jurkat in fase G2/M (24,7%) e conseguente calo della fase G0/G1 è stato osservato dopo incubazione di 24 ore con 1g alla concentrazione di 1.5 M. Dopo 48 ore le percentuali delle cellule andate incontro a meccanismo di morte cellulare per apoptosi e/o necrosi sono state rilevate tramite citofluorimetria dopo colorazione con Annessina V-FITC e PI. Si è evidenziata la capacità del composto 1g a provocare un aumento significativo di apoptosi precoce dopo 24 ore di incubazione mentre dopo 48 ore il composto causa una forte induzione di apoptosi tardiva e necrosi in cellule trattate. è stata valutata mediante western blot l’espressione di specifiche proteine coinvolte nel meccanismo di morte cellulare mediato da 1g. In particolare, si è osservato un aumento della P53 mentre la proteina antiapoptotica bcl-xl e bcl-2 risultano diminuite in modo dose-dipendente nelle cellule Jurkat. È stato inoltre valutato il meccanismo d’azione coinvolto nell’arresto del ciclo cellulare, precisamente durante la transizione G2/M. Abbiamo trovato un aumento significativo della ciclina B1, Myt-1, P-H3 e P-Cdc2, mentre diminuisce l’espressione della Wee1 e P-Wee1. In conclusione, i nostri dati dimostrano chiaramente che il composto 1g è in grado di arrestare in fase G2/M il ciclo cellulare nelle cellule leucemiche jurkat T cells dopo 12 ore di incubazione e di conseguenza di indurre apoptosi precoce e tardiva. Presi insieme, questi risultati suggeriscono che questa molecola potrebbe agire principalmente come un composto citostatico piuttosto che citotossico.