Tools molecolari per la detection di batteri farmaco-resistenti e nuovi approcci terapeutici per il trattamento del cancro e la medicina rigenerativa

Durante il mio Dottorato di Ricerca, sono stato coinvolto in tre progetti, aventi come obiettivo a) l’identificazione di inibitori non β-lattamici come potenziali agenti anti-infettivi; b) la selezione di modulatori della proliferazione e differenziazione di cellule staminali; c) l’ottimizzazione di composti peptidici per il trattamento del tumore ovarico. In particolare, a) ha rappresentato il principale focus di ricerca mentre b) e c) sono stati sviluppati in modo meno estensivo. a) I microorganismi produttori di β-lattamasi rappresentano alcuni dei più aggressivi agenti patogeni responsabili di molte infezioni farmaco-resistenti. Particolarmente rilevanti sono le β-lattamasi ad ampio spettro, in grado d’idrolizzare anche gli antibiotici di ultima generazione [1]. All’interno del progetto FP7 OPTObacteria sono state selezionate alcune delle β-lattamasi piú rilevanti dal punti di vista clinico, per le quali mi sono occupato della messa a punto della procedura di purificazione e della caratterizzazione cinetica. Un database commerciale di circa 200.000 molecole è stato studiato mediante approcci computazionali di structure-based virtual screening nei confronti delle β-lattamasi selezionate allo scopo d’identificare nuovi potenziali inibitori. Le molecole più interessanti, sono state acquistate e testate in saggi biochimici per valutarne l’effettiva attivitá. Il profilo di inibizione dei composti nei confronti delle varie β-lattamasi è stato valutato mediante un saggio colorimetrico automatico in modalità “medium-high throughput screening”. I valori di IC50 e Ki sono stati calcolati. I composti più promettenti sono stati ancorati alla superficie di opportune fibre ottiche allo scopo di produrre tools diagnostici per la rilevazione, in campioni biologici, di enzimi β-lattamici quali biomarkers di resistenza batterica. b) Le proteine hYAP1 and hTEAD4 sono gli effettori terminali della cascata chinasica Hippo pathway, responsabile dell’attivazione della proliferazione e della differenziazione cellulare di cellule staminali. In particolare, il complesso dimerico YAP-TEAD è stato riconosciuto come un potenziale target per lo sviluppo di nuovi approcci terapeutici anticancro e per applicazioni di medicina rigenerativa [2]. Nell’ambito del progetto Novamolstam, mi sono personalmente occupato della determinazione delle condizioni sperimentali ottimali per l’espressione eterologa di entrambe le proteine in ospiti batterici, e della loro purificazione. Una libreria in house di potenziali inibitori della formazione del complesso YAP-TEAD è stata selezionata, per i quali ho progettato un saggio biochimico basato sulla fluorescenza al fine di determinarne l’effetto inibitorio. I risultati ottenuti sono ancora preliminari ma promettenti. La citotossicità e l’attività biologica dei composti selezionati sono state anche valutate mediante un saggio reporter a livello cellulare. c) La Timidilato Sintasi umana (hTS) è un enzima omodimerico coinvolto nella sintesi del DNA, spesso sovraespresso nelle cellule di tumore ovarico. Nuovi composti peptidici in grado di legare specificamente l’interfaccia dimerica dell’enzima sono stati progettati e coniugati con sonde fluorescenti e acido folico in modo da monitorarne il processo di internalizzazione cellulare [3]. Mi sono occupato della purificazione e della caratterizzazione del profilo cinetico dell’enzima, ho eseguito i saggi di inibizione dei composti peptidici sintetizzati mediante saggio spettrofotometrico, determinandone i valori di IC50 e Ki. Nuovi potenziali inibitori di hTS sono stati identificati. REFERENCES [1] Farina D. et al.; Curr Med Chem, 2014, PMID:24180276; [2] Santucci M. et al.; J Med Chem, 2014, PMID:25719868; [3] Pelà Michela et al.; J Med Chem, 2014, PMID:24450514.