Effetti del silenziamento e dell'inibizione della proteasi Lon sui mitocondri di cellule tumorali

Lon è una proteasi mitocondriale, ATP-dipendente, codificata nel nucleo, che interviene nel ripiegamento delle proteine, degrada le proteine ossidate o danneggiate, prevenendo il loro accumulo, e partecipa al mantenimento dei livelli del DNA mitocondriale (mtDNA). Lon è indotta da diversi fattori di stress e la sua attività ed espressione sono modulate in diverse patologie. Lon è up-regolata in diverse cellule tumorali umane, e la riduzione dell'espressione di questa proteina causa profonde alterazioni del proteoma mitocondriale e delle funzioni dell’organello, portando alla fine alla morte cellulare. L'attività enzimatica di Lon è indotta dall'ATP, e inibita dal triterpenoide 2-ciano-3,12-dioxooleana-1,9-dien-28-oico (CDDO), e dal suo derivato C-28 metil estere (CDDO-Me). Al fine di chiarire il ruolo della proteasi Lon nelle trasformazione neoplastica, abbiamo analizzato gli effetti della down-regolazione di Lon in un modello cellulare di tumore al colon (cellule tumorali di colon RKO) in cui Lon è stata condizionatamente silenziata mediante RNA interference. Abbiamo studiato l'impatto della down-regolazione di Lon sull'apoptosi cellulare, sui livelli di mtDNA e mtRNA, sulla funzionalità e morfologia mitocondriale. Inoltre, abbiamo valutato gli effetti dell'inibizione farmacologica di Lon, usando CDDO o CDDO-Me. In particolare, abbiamo studiato gli effetti dei triterpenoidi sui mitocondri di tre linee cellulari di tumore (RKO, cellule umane di tumore al colon; HepG2, cellule umane di epatocarcinoma; MCF7, cellule umane di carcinoma mammario). Abbiamo analizzato diversi parametri, quali il potenziale di membrana, la massa, la morfologia, il contenuto ROS e l'attività proteolitica di Lon. I mitocondri delle cellule in cui Lon è silenziato sono caratterizzate da bassi livelli di trascritti di mtDNA, minori livelli di alcune subunità dei complessi della fosforilazione ossidativa (il complesso I è risultato il più colpito), da una marcata riduzione del tasso di consumo di ossigeno, e dalla ridotta capacità sintetizzare l'ATP. Inoltre, sono stati osservati alti livelli di perossido d’idrogeno e di anione superossido mitocondriale. La rete mitocondriale è apparsa frammentata, con mitocondri eterogenei nella forma e nelle dimensioni, creste dilatate, vacuoli e inclusioni elettrondense. Inoltre, abbiamo osservato che CDDO e CDDO-Me sono potenti fattori di stress per i mitocondri nelle cellule tumorali, poiché inducono livelli più elevati di ROS e alterano la morfologia mitocondriale, mentre tale effetto è risultato molto meno marcato nelle cellule normali non trasformate. In particolare, queste molecole hanno causato una depolarizzazione della membrana mitocondriale e un'alterazione della massa mitocondriale, hanno influenzato i livelli di Lon e quelli di ACO2 e TFAM, due target dell'attività proteolitica di Lon, e hanno indotto apoptosi mediante la via intrinseca. La overespressione di Lon è apparsa in grado di ridurre la morte cellulare per apoptosi nelle cellule trattate con CDDO e CDDO-Me. In conclusione, Lon può essere considerata una proteina che non induce tumorigenesi di per sé, ma è importante per la sopravvivenza delle cellule tumorali. La sua inibizione farmacologica potrebbe quindi rappresentare una nuova possibile strategia antitumorale.