Ruolo dei microRNA nel differenziamento monocitario

I microRNA (miRNA) sono una famiglia di piccoli RNA non codificanti (19-25 nucleotidi) che regolano negativamente l'espressione genica a livello post-trascrizionale. I miRNA agiscono in numerosi processi cellulari come lo sviluppo, la proliferazione, l’ apoptosi, il differenziamento e la cancerogenesi. Studi recenti hanno dimostrato un ruolo essenziale dei miRNAs anche nell’emopoiesi normale e patologica. L’emopoiesi è un processo gerarchico finemente controllato da complessi eventi molecolari che regolano la proliferazione, il differenziamento e l’apoptosi delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). L'attivazione di diversi programmi di differenziamento avviene mediante l’attivazione o l’inibizione di network di fattori trascrizione. Fattori di trascrizione (TF) e miRNA collaborano strettamente nella regolazione dell'espressione genica durante il differenziamento emopoietico: i TF regolano l'espressione dei geni dei miRNA, e allo stesso tempo i miRNA hanno come target i TF. Un’alterata espressione dei miRNA può portare all’insorgenza di disordini ematopoietici come la leucemia mieloide acuta (AML). In un recente studio (Lutherborrow et al., 2010) è stata analizzata l'espressione genica dei miRNA in pazienti affetti da Leucemia Mieloide Acuta (AML), con particolare attenzione ai miRNA differenzialmente espressi nei sottotipi FAB M1 e M5. Il risultato di tale comparazione ha evidenziato l’overespresione dei miR-146ab, miR-181abd, miR-130a, miR-663, miR-135b. I target dei miRNA indicati, in particolare del miRNA130a, risultano essere Klf4, MafB, IRF8 e HoxA10, master regulators del differenziamento monocitario. Si è ipotizzato che i miRNA sopra elencati potessero essere coinvolti nel blocco differenziativo dei blasti M1. Lo scopo di questo lavoro riguarda lo studio di funzione del miR-130a nel differenziamento emopoietico, al fine di chiarirne il ruolo nella monocitopoiesi. Inizialmente è stato valutato il livello di espressione del miR-130a nella mielopoiesi (HSC, mieloblasti, monoblasti, granulociti e monociti) e nelle HSC stimolate con vitamina D3. I dati ottenuti mostrano una down-regolazione del miRNA-130a nel differenziamento monocitario. Sono stati condotti studi di gain- and loss-of-function, attraverso trasfezione di molecole mimanti (pre-miR) o inibenti (anti-miR) in cellule CD34+. La capacità differenziativa delle cellule trattate è stata analizzata attraverso qRT-PCR, Western blot, saggi immunofenotipici e funzionali. I campioni overesprimenti il miR-130a mostrano un chiaro rallentamento del differenziamento monocitario, documentato dal risultato ottenuto nel CFU assay che mostra un aumento delle CFU-GM e una diminuzione delle CFU-M, dato cofermato dall’analisi dell’espressione genica dei marker differenziativi monocitari (CD14, CD163 and MRC1), delle citochine infiammatorie (IL-1, IL-6, IL-8, IL10RB, CCL2 e TNFa) e dal fattore di trascrizione CEBPβ, infatti tutti risultano essere down-regolati. Per confermare i dati ottenuti, sono stati effettuati le stesse analisi in campioni di CD34+ trasfettati con anti-miR130a; come atteso i risultati hanno mostrato un aumento del differenziamento monocitario. Questo studio evidenzia il ruolo del miR-130a nella modulazione della monocitopoiesi, confermando che l’overespressione del miRNA perturba il normale differenziamento, contribuendo al blocco differenziativo caratterizzante le AML M1. Questi dati suggeriscono l’utilizzo di una strategia antimiR in grado di ristabilire un corretto profilo d'espressione genica, permettendo il normale differenziamento dei progenitori mieloidi. A tal fine, abbiamo deciso di utilizzare acidi peptido-nucleici (PNA) per regolare l’espressione del miR-130a. I risultati preliminari mostrano un aumento del differenziamento monocitario nelle CD34+ e nelle linee cellulari di AML.