Il ripristino dell’espressione di Tristetraprolina in cellule di cancro colorettale inibisce la transizione epitelio-mesenchimale attraverso la repressione di specifici geni bersaglio

Tristetraprolina (TTP) è una proteina la cui funzione è quella di legare sequenze ricche in Adenina e Uracile (chiamate sequenze ARE) nel 3’ non-tradotto (3’UTR) di molti trascritti e di inibirne l’espressione. TTP e altri membri della stessa famiglia esercitano un ruolo fondamentale nel regolare l’espressione di molti geni proinfiammatori o oncogeni e, infatti, la perdita della loro funzione può contribuire alla trasformazione tumorale in molti contesti diversi, fra cui il cancro colorettale (CRC). Evidenze sperimentali riportano una progressiva perdita di espressione di TTP ed una concomitante induzione dei suoi geni target a partire dai primi stadi di tumorigenesi, tuttavia poco si conosce del suo ruolo in questo processo. Il nostro scopo è stato quindi quello di approfondire il ruolo di questa proteina nella biologia della mucosa colo-rettale e nel suo processo di trasformazione tumorale. A tal fine abbiamo identificato tre nuovi bersagli putativi di TTP che risultano essere coinvolti in questo processo: MACC1, ZEB1 e SOX9. Questi geni mostrano un’attività oncogenica e sono coinvolti nel processo di transizione epitelio-mesenchimale (EMT), anche se in maniera diversa. Al fine di validarli come bersagli di TTP abbiamo svolto esperimenti di over-espressione che hanno mostrato come, in presenza di TTP, vengano fortemente inibiti sia a livello trascrizionale che proteico. Inoltre abbiamo svolto saggi funzionali dove la presenza del 3’UTR di questi geni risulta sufficiente per diminuire l’attività dell'enzima Luciferasi quando TTP viene over-espresso, confermando l'osservazione precedente. Successivamente abbiamo analizzato gli effetti di TTP sull’EMT. Coerentemente con il ruolo dei suoi geni target abbiamo potuto osservare come questa proteina causi l’aumento dei marcatori epiteliali E-Caderina e ZO-1(Zona Occludens 1) e la concomitante diminuzione dei marcatori mesenchimali Vimentina e N-caderina. Esperimenti di immunofluorescenza hanno rivelato che E-caderina non è solo più espressa, ma è maggiormente concentrata nelle giunzioni cellulari. L' over-espressione di TTP conferisce inoltre una maggiore impedenza al monostrato cellulare, una caratteristica tipica delle cellule epiteliali. Alla luce di questi dati ci siamo chiesti se queste modificazioni fenotipiche influiscano sul comportamento cellulare e in particolare sui processi coinvolti nell’EMT. Abbiamo quindi analizzato la migrazione cellulare ma, sorprendentemente, non abbiamo registrato nessuna differenza significativa sia attraverso saggi tradizionali che basati sull’impedenza. In secondo luogo ci siamo focalizzati sulla capacità di crescita in assenza di ancoraggio. Saggi di soft-agar hanno evidenziato come la presenza di TTP diminuisca il numero e la dimensione delle colonie ottenute coltivando le cellule in un terreno semisolido. Inoltre abbiamo analizzato la vitalità cellulare in condizioni di crescita in assenza di adesione e abbiamo verificato come questa proteina renda le cellule più sensibili all’anoikis. Infine abbiamo indagato la relazione fra TTP e la via di segnalazione molecolare mediata da Wnt. I risultati ottenuti mostrano come l' inibizione di questa via di segnale attraverso un composto chimico induca l’espressione di TTP in maniera tempo-dipendente e ,al contrario, come il trattamento delle linee cellulari con Wnt3a ne reprima l’espressione sia a livello proteico che di mRNA. Questi dati indicano che il silenziamento di TTP osservato nel CRC determina un'alterazione dell’espressione dei suoi geni target coinvolti nell’EMT. Inoltre suggeriscono che questo fenomeno possa essere correlato con l’attivazione costitutiva della via di segnalazione di Wnt che è di fondamentale importanza nella patogenesi del CRC.