Ruolo della Calreticulina (CALR) nel differenziamento emopoietico e nello sviluppo di neoplasie mieloproliferative.

Le neoplasie mieloproliferative BCR-ABL negative (MPNs), sono disordini clonali della cellula staminale caratterizzati da un’aumentata proliferazione delle cellule mieloidi terminalmente differenziate. Le basi molecolari delle MPNs sono state identificate pochi anni fa con l’identificazione di due mutazioni somatiche nei geni JAK2 e MPL. Recentemente, sono state riportate mutazioni nel gene della calreticulina (CALR) nel 60-80% dei pazienti non mutati per JAK2 e MPL. CALR è un chaperone che lega il calcio localizzato nel lume del reticolo endoplasmatico e le sue mutazioni risultano nella perdita di buona parte del dominio c-terminale e del segnale KDEL, che potrebbe causare mis-localizzazione e aberrante funzionalità della proteina. Per esplorare il ruolo delle mutazioni di CALR nel differenziamento di cellule progenitrici/staminali emopoietiche (HPSCs), abbiamo studiato gli effetti dell’overespressione di CALR mutato in cellule CD34+ cordonali. Il monitoraggio ha mostrato che l’espressione forzata di CALR WT e mutato è in grado di indurre il commitment emopoietico attraverso i lineage megacariocitario (MK) ed eritroide. Al contrario, il silenziamento di CALR induce repressione del differenziamento MK ed eritroide. Per caratterizzare gli effetti delle mutazioni di CALR a livello molecolare, abbiamo analizzato i profili di espressione di cellule CD34+ cordonali overesprimenti CALR WT e mutato. L’analisi ha identificato una lista di geni differenzialmente espressi. Tra i geni up-regolati, abbiamo evidenziato geni coinvolti nell’aggregazione piastrinica, infiammazione e differenziamento eritroide, potenzialmente correlati alle caratteristiche della malattia. L’elevata espressione di CALR endogeno, non ci ha permesso di valutare completamente gli effetti indotti dalla proteina mutata. Perciò abbiamo effettuato il knock-out di CALR endogeno in K562, una linea cellulare eritromieloblastoide, con l’utilizzo della tecnologia CRISPR/Cas9 e di conseguenza abbiamo overespresso CALR WT e mutato. CALR è stato descritto come coinvolto nella morte cellulare immuno mediata (ICD) e la sua esposizione sulla memebrana plasmatica di cellule morenti ne favorisce il riconoscimento e l’eliminazione da parte di fagociti professionisti. Dopo aver trattato le K562 con induttori di ICD, abbiamo notato la diminuizione di CALR mutato a livello della membrana plasmatica, suggerendo un ruolo di CALR mutato nell’eludere il sistema immunitario, che solitamente caratterizza le cellule tumorali. Infine per ottenere maggiori evidenze che le mutazioni di CALR sono associate allo sviluppo di disordini mieloproliferativi, abbiamo adottato un modello murino. A questo fine, cellule midollari lineage negative (Lin-) ottenute da topi Ly5.1, sono state trasdotte ex vivo con un vettore retrovirale codificante per CALR WT e mutato e successivamente sono state trapiantate in topi singenici letalmente irradiati attraverso la vena della coda. Ad oggi, sono stati trapiantati 28 topi, 3 topi per costrutto sono stabilmente ricostituiti con le cellule del donatore, mostrando un livello di enfgraftment attorno al 75% nel sangue periferico. I topi saranno sacrificati 9-12 mesi dopo il trapianto per verificare se e con quale estensione le mutazioni di CALR sono responsabili dello sviluppo della malattia. In conclusione, questi dati suggeriscono un ruolo di CALR nella regolazione dello sviluppo eritroide e MK, i due lineage più colpiti nelle MPNs. Inoltre, i dati di espressione sulle K562 CALR -/- hanno mostrato che CALR è coinvolto nella regolazione dell’espressione genica di diversi geni responsabili dello sviluppo leucemico e suggeriscono un potenziale ruolo di CALR mutato nell’eludere il sistema immunitario. Nel complesso, i nostri dati supportano fortemente un ruolo di CALR nello sviluppo di una sindrome mieloproliferativa.