UN SISTEMA DI COLTURA DI CELLULE EPITELIALI PER LA RIGENERAZIONE DELL'URETRA: SAGGI PRECLINICI IN VITRO ALTERNATIVI AI MODELLI ANIMALI

Recenti scoperte nel campo delle terapie cellulari, basate sulla cultura di cellule staminali somatiche, hanno generato la nascita di numerosi dispositivi a sostegno della medicina rigenerativa. Da qui è nata la necessità di valutare l'efficacia e la sicurezza di questi materiali. Svariati modelli animali sono stati sviluppati, al fine di valutare tali terapie avanzate. Tuttavia, il modello animale perfetto non esiste; c'è sempre un'incongruenza quando si passa all'uomo. Al fine di ottenere risultati più predittivi, devono essere usate cellule autologhe umane nei test preclinici in vitro. Solo un sistema consolidato di coltura cellulare può dare forza ai dati preclinici diventando così un vero e proprio modello in vitro. Un esempio è dato da un test in vitro per valutare la tossicità di una colla per la ricostruzione chirurgica dell'uretra, in caso di stenosi. Il restringimento rende difficile la minzione, danneggia la funzionalità della vescica e può causare infezioni, si rende così necessaria l'uretroplastica. Questa procedura richiede un tessuto sano per la riparazione, un innesto autologho prelevato dalla cavità orale. Il lavoro pionieristico di Rheinwald e Green ha reso possibile la coltivazione di cheratinociti umani utilizzando un feeder layer di cellule 3T3-J2 letalmente irradiate, introducendo così una condizione insostituibile per la terapia cellulare a base di cellule staminali epiteliali. In questo studio, sfruttando queste tecnologie, abbiamo valutato l'effetto biologico di una colla chirurgica a base di cianoacrilato in un modello di coltura di fibroblasti e di epiteli uretrale e di mucosa. Una colla biologica tessutale (colla di fibrina), già utilizzata in clinica, è stato usata come controllo. Biopsie di uretra bulbare e di mucosa orale sono state ottenute da pazienti durante la chirurgia ricostruttiva, previo consenso informato. Le cellule epiteliali di uretra e mucosa orale sono state coltivate come descritto da Corradini et al. nel 2015 e i fibroblasti sono stati isolati da espianto e coltivati su plastica. La citotossicità è stata valutata sulle cellule dopo l'esposizione al cianoacrilato e alla colla a base di fibrina. Le culture sono state sottoposte a analisi d'immagine subito dopo il contatto e fino a 47 giorni, mentre la vitalità cellulare è stata quantificata a 24 ore e a 7 giorni. Gli effetti a lungo termine sui fibroblasti e sugli epiteli sono stati valutati attraverso subcolture e con il test di efficienza di formazione di colonie (CFE), rispettivamente. Le colture di fibroblasti esposte alla colla cianoacrilica, hanno mostrato un alone privo di cellule che circonda la colla, suggerendo una certa citotossicità. L'alone è diminuito nel tempo nelle culture epiteliali e di fibroblasti fino alla completa scomparsa, in 8 e 7 giorni rispettivamente. Le colture in contatto con la colla di fibrina non hanno mostrato né alone né tossicità. L'area della colla polimerizzata, in 47 giorni, è stata ridotta fino al 20% nei fibroblasti uretrali e al 10% in quelli di mucosa orale. L'analisi della vitalità e della morfologia dopo il contatto con le colle a 24 ore e 7 giorni non ha mostrato differenze significative. Entrambe le subcolture analizzate a 24h, 4 e 8 giorni dopo il ripiastramento, non mostravano differenze nel numero di cellule morte. Si nota che gli epiteli di uretra e di mucosa orale hanno evidenziato una tossicità transitoria nella vitalità cellulare dopo il contatto con la colla cianoacrilica. L'effetto a lungo termine ha mostrato un recupero di questa citotossicità valutata con il test CFE. Lo studio dimostra che la colla di cianoacrilato, ha solo un effetto tossico transitorio sia nelle cellule di uretra che in quelle di mucosa orale, sostenendo così la sua applicazione nella ricostruzione uretrale.