Caratterizzazione di cellule staminali epiteliali per un approccio efficace di terapia genica ex vivo.

L’Epidermolisi Bollosa è una famiglia di malattie genetiche rare della pelle causata da mutazioni in geni codificanti per proteine di adesione derma-epidermide per la quale attualmente non esiste una cura. Nel 2006 è stato sviluppato un trial clinico di fase I per un paziente JEB-Laminina dipendente con una strategia di gene therapy ex-vivo e il successo di questo approccio ha dimostrato che per la correzione a lungo termine dell’epidermide del paziente è necessario trasdurre un numero definito di cellule staminali epiteliali (olocloni). Tuttavia attualmente non esistono marker di membrana specifici che permettano l’isolamento e la trasduzione di questa popolazione in coltura e per questo è necessario ottenere un’efficienza di trasduzione vicina al 100% che ne garantisca la correzione all’interno di una coltura eterogenea. Abbiamo sviluppato lo stesso approccio per correggere cellule derivate da pazienti JEB-Col17 dipendenti utilizzando vettori retrovirali MLV derivati e vettori SIN. Per i vettori MLV abbiamo generato una linea cellulare di packaging AM12-Col17 e i cloni sono stati selezionati e utilizzati per trasdurre i cheratinociti con il sistema di co-coltura ottenendo un’efficienza di trasduzione del 95%. I cheratinociti trasdotti sono stati quindi mantenuti in coltura e attraverso saggi di colony forming efficiency abbiamo valutato la tossicità cellulare, mentre la trasduzione delle staminali è stata confermata attraverso il saggio di analisi clonale. In parallelo abbiamo realizzato gli stessi esperimenti utilizzando diversi costrutti SIN che differivano per i promotori endogeni e per lo scheletro virale e dopo aver scelto il vettore più funzionale per il nostro sistema di coltura, stiamo testando diversi cloni della packaging SIN per scegliere il migliore in termini di efficienza di trasduzione. Per entrambe le strategie (MLV e SIN) sono in corso saggi di genotossicità per valutare il profilo di safety in termini di potenziale mutagenesi inserzionale quali: soft agar, coltivazione seriale e saggio di dipendenza da fattori di crescita. In parallelo abbiamo allestito altri esperimenti per trovare un potenziale marker delle cellule staminali epiteliali che ne possa permettere l’identificazione e eventualmente la selezione e possa essere usato in clinica nei protocolli di terapia genica. Abbiamo quindi confrontato il profilo trascrizionale delle cellule staminali epiteliali (olocloni) con quello delle cellule transient ampifying (merocloni) e le analisi bioinformatiche dei microarray hanno permesso di identificare i geni differenzialmente espressi e di descrivere una signature molecolare per ogni classe di cloni. Inoltre i dati sono stati analizzati con il software di analisi Ingenuity per riconoscere le interazioni molecolari, le funzioni e le pathway differenzialmente espresse tra olocloni e meerocloni. I geni che sono risultati up-regolati negli olocloni rispetto ai merocloni sono stati validati attraverso real-time PCR e la relativa espressione proteica è stata valutata attraverso western blot e immunofluorescenza. Inoltre abbiamo allestito studi di arricchimento e perdita della funzione proteica per verificare il ruolo di questi geni nell’omeostasi dei cheratinociti. Con questi dati preliminari possiamo confermare che olocloni e merocloni hanno un profilo di espressione genica diverso e questo permette di identificare con chiarezza una signature molecolare che definisce la popolazione di cellule staminali epiteliali. Questo studio ha quindi un impatto importante sulla gene therapy perché potrebbe migliorare notevolmente l’efficienza di trasduzione delle staminali assicurando così una correzione definitiva dell’epidermide dei pazienti EB.