I tessuti epiteliali ricoprono le cavità e le superfici di tutto il corpo. I cheratinociti dello strato basale giacciono sulla membrana basale e sono le sole cellule dell’epitelio stratificato dotate di capacità proliferativa. Le cellule staminali, le cellule “transient amplifying” (TA) e le TA precoci, isolate in coltura danno vita rispettivamente a olocloni, merocloni e paracloni. È stato dimostrato che il fattore di trascrizione p63 è abbondantemente espresso in olocloni di pelle e limbus corneale. Ad oggi p63 è uno dei pochi marcatori di cellule staminali identificati in pelle e limbus. A partire da queste considerazioni sono stati studiati altri epiteli di rivestimento. L’epitelio analizzato in questo studio è la mucosa orale. Questo tessuto è largamente utilizzato in chirurgia come strumento per la medicina rigenerativa. Ad esempio, in oftalmologia è stato trapiantato come tessuto sostitutivo della cornea in casi di Deficit Bilaterale di Cellule Staminali Limbari (LSCD). Il primo passo verso una rigenerazione in vitro della mucosa è una sua completa caratterizzazione, specialmente nel compartimento staminale e nelle cellule differenziate, al fine di avere appropriati saggi di controllo qualità e di rilascio. I campioni di mucosa orale sono stati prelevati da numerosi donatori sani. Sono state allestite colture primarie, poi coltivate fino a differenziamento e senescenza. Sono stati ottenuti olocloni, merocloni e paracloni da analisi clonali di differenti donatori e, parte delle biopsie, sono state criopreservate per analisi in vivo. Sono state studiate le citocheratine sia in vivo che in vitro per confrontarne l’espressione tra la mucosa in in vivo e quella coltivata in laboratorio. Inoltre, sono stati studiati possibili marcatori di cellule staminali. Il primo fattore analizzato, è il fattore di trascrizione p63, per ragioni già evidenziate in altri epiteli di rivestimento. Sono stati analizzati anche altri due marcatori correlati alle staminali limbari, Bmi1 e C/EBPdelta. Infine, sono state studiate altre proteine come Klf4 e Sox2, per la loro correlazione alla tumorigenesi della mucosa orale e di altri epiteli, e per la loro importanza nelle staminali embrionali. Il recettore p75 è stato analizzato per il ruolo descritto in letteratura di mantenimento della staminalità nella mucosa orale. I pattern di espressione in vivo sono stati identificati attraverso immunofluorescenza in criosezioni confermando la presenza dei marcatori selezionati in cellule basali o soprabasali. Inoltre sono state svolte analisi in vitro come western blot di lifespan o di singoli tipi clonali. Alcuni fattori mostravano una riduzione della loro espressione durante la conversione clonale rivelando la loro importanza negli stadi indifferenziati della coltura. Per il trapianto ex vivo della mucosa orale nella LSCD il problema rimane la univoca identificazione di mucosa da cornea e da congiuntiva per interpretare correttamente il follow-up dei pazienti. Attraverso microarray tra i vari mRNA estratti da olocloni di limbus, congiuntiva e mucosa orale abbiamo individuato tre marcatori candidati per la caratterizzazione della mucosa: Pax6, Pitx2 e Sox2. I trascritti e l’espressione proteica dei tre marcatori è stata studiata sia in vivo che in vitro nei tre tessuti. Bmi1 è stato studiato approfonditamente considerando la sua espressione nella mucosa orale, in vivo ed in vitro, rispecchiando quella riscontrata nel limbus corneale dove è stato già associato a staminalità. Per queste ragioni abbiamo studiato la sua funzione ed i pathways associati, con esperimenti di silenziamento. Questi studi sono mirati al disegno di saggi di controllo qualità o di rilascio per la ricostruzione in vitro della mucosa orale finalizzata a protocolli di terapia cellulare.

Definizione di marcatori molecolari per la selezione di cellule staminali della mucosa orale.

2017

Abstract

I tessuti epiteliali ricoprono le cavità e le superfici di tutto il corpo. I cheratinociti dello strato basale giacciono sulla membrana basale e sono le sole cellule dell’epitelio stratificato dotate di capacità proliferativa. Le cellule staminali, le cellule “transient amplifying” (TA) e le TA precoci, isolate in coltura danno vita rispettivamente a olocloni, merocloni e paracloni. È stato dimostrato che il fattore di trascrizione p63 è abbondantemente espresso in olocloni di pelle e limbus corneale. Ad oggi p63 è uno dei pochi marcatori di cellule staminali identificati in pelle e limbus. A partire da queste considerazioni sono stati studiati altri epiteli di rivestimento. L’epitelio analizzato in questo studio è la mucosa orale. Questo tessuto è largamente utilizzato in chirurgia come strumento per la medicina rigenerativa. Ad esempio, in oftalmologia è stato trapiantato come tessuto sostitutivo della cornea in casi di Deficit Bilaterale di Cellule Staminali Limbari (LSCD). Il primo passo verso una rigenerazione in vitro della mucosa è una sua completa caratterizzazione, specialmente nel compartimento staminale e nelle cellule differenziate, al fine di avere appropriati saggi di controllo qualità e di rilascio. I campioni di mucosa orale sono stati prelevati da numerosi donatori sani. Sono state allestite colture primarie, poi coltivate fino a differenziamento e senescenza. Sono stati ottenuti olocloni, merocloni e paracloni da analisi clonali di differenti donatori e, parte delle biopsie, sono state criopreservate per analisi in vivo. Sono state studiate le citocheratine sia in vivo che in vitro per confrontarne l’espressione tra la mucosa in in vivo e quella coltivata in laboratorio. Inoltre, sono stati studiati possibili marcatori di cellule staminali. Il primo fattore analizzato, è il fattore di trascrizione p63, per ragioni già evidenziate in altri epiteli di rivestimento. Sono stati analizzati anche altri due marcatori correlati alle staminali limbari, Bmi1 e C/EBPdelta. Infine, sono state studiate altre proteine come Klf4 e Sox2, per la loro correlazione alla tumorigenesi della mucosa orale e di altri epiteli, e per la loro importanza nelle staminali embrionali. Il recettore p75 è stato analizzato per il ruolo descritto in letteratura di mantenimento della staminalità nella mucosa orale. I pattern di espressione in vivo sono stati identificati attraverso immunofluorescenza in criosezioni confermando la presenza dei marcatori selezionati in cellule basali o soprabasali. Inoltre sono state svolte analisi in vitro come western blot di lifespan o di singoli tipi clonali. Alcuni fattori mostravano una riduzione della loro espressione durante la conversione clonale rivelando la loro importanza negli stadi indifferenziati della coltura. Per il trapianto ex vivo della mucosa orale nella LSCD il problema rimane la univoca identificazione di mucosa da cornea e da congiuntiva per interpretare correttamente il follow-up dei pazienti. Attraverso microarray tra i vari mRNA estratti da olocloni di limbus, congiuntiva e mucosa orale abbiamo individuato tre marcatori candidati per la caratterizzazione della mucosa: Pax6, Pitx2 e Sox2. I trascritti e l’espressione proteica dei tre marcatori è stata studiata sia in vivo che in vitro nei tre tessuti. Bmi1 è stato studiato approfonditamente considerando la sua espressione nella mucosa orale, in vivo ed in vitro, rispecchiando quella riscontrata nel limbus corneale dove è stato già associato a staminalità. Per queste ragioni abbiamo studiato la sua funzione ed i pathways associati, con esperimenti di silenziamento. Questi studi sono mirati al disegno di saggi di controllo qualità o di rilascio per la ricostruzione in vitro della mucosa orale finalizzata a protocolli di terapia cellulare.
10-mar-2017
Italiano
BIO/12
PELLEGRINI GRAZIELLA
TUPLER ROSSELLA
Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/20.500.14242/142968
Il codice NBN di questa tesi è URN:NBN:IT:UNIMORE-142968