Nuove evidenze sull'ecosistema intestinale umano: un approccio metagenomico

Il tratto gastrointestinale umano è un ambiente complesso e popolato da centinaia di specie batteriche (circa 1012cellule/g di feci), archea ed eucarioti. Questo progetto riguarda l’applicazione delle tecnologie di Next Generation Sequencing per due ambiti di ricerca volti ad una caratterizzazione più approfondita del microbiota intestinale umano: da un lato lo studio dei funghi intestinali, dall’altro l’identificazione di gruppi batterici capaci di usare proteine e amminoacidi come fonti di carbonio. La popolazione eucariotica rappresenta una componente importante nell’ecosistema intestinale, in grado di svolgere ruoli sia positivi che negativi per la salute, ma rimane relativamente poco caratterizzata. L’impiego di metodi coltura dipendenti ha dimostrato che la concentrazione di funghi isolati dalle feci di individui sani risulta essere inferiore a 105 cellule/g suggerendo che questi rappresentano una piccola parte del microbiota intestinale, ma risulta ancora da chiarire se si tratta di una colonizzazione permanente o transiente. Questa parte del progetto ha avuto come scopo lo studio della popolazione fungina intestinale in 8 adulti sani confrontando campioni fecali nell’arco di un anno (tempo 0, dopo 3 mesi e dopo 12 mesi). La composizione di tale popolazione, in termini di concentrazione e attribuzione tassonomica, è stata analizzata attraverso l’impiego di tecniche sia coltura dipendenti che indipendenti. L’analisi metagenomica, eseguita con successo su 14 campioni ha permesso di identificare 155 OTUs corrispondenti a differenti specie e generi fungini. La maggior parte dei funghi è stata caratterizzata a livello di genere. Confrontando la caratterizzazione tassonomica svolta sugli isolati da coltura con quella metagenomica, quest’ultima ha identificato nuovi generi facilmente riferibili alla frazione fungina non coltivabile. La seconda parte dello studio ha riguardato la caratterizzazione della popolazione batterica intestinale in grado di sviluppare su terreno contenente proteine come fonte di carbonio. Il metabolismo delle proteine ad opera della popolazione batterica commensale intestinale ha numerosi effetti sulla salute dell’ospite in quanto porta alla produzione di composti potenzialmente tossici (es. indolo, cresolo, ammonio). Al fine di identificare i gruppi batterici coinvolti nel catabolismo intestinale delle proteine, colture di microbiota intestinale umano sono state condotte in modelli in vitro impiegando un terreno di crescita in cui proteine e peptoni rappresentavano la sola fonte di carbonio. Le colture sono state incubate a 37 °C (pH 6.8) in stretta anaerobiosi. La composizione del microbiota è stata studiata al tempo iniziale e dopo 6 ore di processo tramite sequenziamento Illumina. Le prime 6 ore di processo sono quelle in cui ci si aspetta il maggiore utilizzo di proteine e peptoni come fonte di carbonio. Successivamente, cambiamenti nella composizione del comunità batterica sono riferibili alla proliferazione di batteri che utilizzano gli amminoacidi disponibili come supporto alla crescita. L’analisi e la caratterizzazione tassonomica delle sequenze, ottenuta tramite l’impiego del software Qiime, ha permesso di ottenere informazioni sul numero di reads associate a ciascuna OTU per campione. A partire da 22 campioni derivati da due tempi di campionamento per 11 processi sono state identificate 24701 OTUs con una clusterizzazione al 97% di similarità di sequenza. Non tutti i taxa identificati sono riferibili a batteri proteolitici. Alcuni possono essere sviluppati impiegando i prodotti di fermentazione (es. acidi organici) di quei batteri “realmente” proteolitici (cross-feeding) o usando i pochi residui di fonti di carbonio presenti nell’inoculo fecale (es. mucina e fibre o polisaccaridi non digeriti).