PROFILO BIOLOGICO DI NUOVI INIBITORI DI TS IN LINEE CELLULARI DI CARCINOMI UMANI

La timidilato sintasi (TS) è un enzima essenziale per il suo ruolo centrale nella biosintesi di timidilato e nella riparazione del DNA, dato che la reazione di metilazione catalizzata da TS è la sola fonte de novo di timidilato (Taddia et al., 2015). Questo enzima è il target principale di molti farmaci antitumorali e la sua inibizione si è dimostrata efficace in molte tipologie di tumore, tra cui il carcinoma colon-rettale (CRC) e ovarico (OC). I farmaci inibitori di TS possono legare il sito attivo agendo come il substrato dUMP, tra questi il 5-FU, o possono agire come il cofattore 5,10-metilen-5,6,7,8-tetraidrofolato, come il Raltitrexed e il Pemetrexed (Taddia et al., 2015). Il principale problema di questi farmaci è legato alla loro tossicità e allo sviluppo di resistenza, un fenomeno multifattoriale ma spesso correlato ad una sovra-espressione di TS, causata dalla perdita dell’azione regolatoria con meccanismo di feedback negativo sul proprio mRNA, quando TS lega gli inibitori (translational de-repression). E’ quindi importante identificare nuovi inibitori che agiscano attraverso nuovi meccanismi, senza alterare la funzione regolatoria o incrementare i livelli di TS (Taddia et al., 2015). A questo scopo, sono stati disegnati e sintetizzati peptidi (LR e [DGln4]LR) e piccoli inibitori dissociativi (DI) per legarsi all’interfaccia proteica (inibitori dell’interazione proteina-proteina) di TS. Questi peptidi hanno mostrato di inibire la crescita cellulare in linee di OC sensibili e resistenti (Cardinale et al., 2011) e anche l’attività enzimatica di TS, senza causarne sovra-espressione (Cardinale et al., 2011; Pelà et al., 2014). L’attività dei peptidi, somministrati sia con uno specifico sistema di delivery non liposomico, poi con liposomi pH-sensibili PEGilati, è stata studiata anche in combinazione con farmaci chemioterapici con uso clinico, per valutarne una possibile attività sinergica. Successivamente, con l’intento di aumentare la selettività, i peptidi LR e [DGln4]LR sono stati coniugati con l’acido folico (FA) per legare il recettore alfa dei folati (FRα) e sfruttare l’endocitosi mediata dal recettore. Poiché FRα è sovra-espresso in più del 90% dei OC non mucinosi, mentre è quasi assente in cellule normali, abbiamo valutato l’effetto sulla crescita dei bioconiugati su linee cellulari tumorali con differenti livelli di FRα, previa valutazione dell’affinità di legame dei bioconiugati nei confronti del FRα. Anche l’effetto dei composti DI sulla crescita cellulare e sull’inibizione dei livelli e dell’attività di TS è stato valutato su diverse linee cellulari tumorali di OC e CRC. Molte delle combinazioni tra farmaci chemioterapici e il peptide [DGln4]LR, somministrato sia coi liposomi che col sistema di delivery, hanno mostrato un effetto additivo in somministrazioni simultanee e sinergico in quelle sequenziali. I bioconiugati inibiscono la crescita cellulare con un effetto comparabile a quello dei peptidi, con FA-[DGln4]LR lievemente più attivo di FA-LR. Il livello di TS si è visto rimanere stabile, suggerendo un meccanismo d’azione simile a quello dei peptidi, basato sull’interazione a livello dell’interfaccia proteica del dimero. Alcuni DI hanno mostrato un buon livello di inibizione della crescita cellulare associato ad un aumento dell’apoptosi. L’attività enzimatica risulta diminuire insieme al livello della proteina, probabilmente a causa di una proteolisi mediata dal proteasoma. I risultati ottenuti da questa ricerca dimostrano che gli inibitori proteina-proteina di TS agiscono tramite un nuovo meccanismo e potrebbero essere efficaci, sia da soli che in combinazione, su linee cellulari di OC e CRC.